Phagozytose und Abbau von EosFP E.coli-Bakterien (transfiziert mit pH-sensitivem Fluoreszenzfarbstoff) in Vollblutproben von Patienten mit schwerer Sepsis und septischem Schock

Abstract

Die vorliegende experimentelle Arbeit stellt einen neuartigen Assay zur simultanen Beurteilung von Phagozytoseleistung und Degradation (intrazellulärer Abbau) vor. Hierfür wurden fluoreszierende „EosFP-E.coli.“ -Bakterien verwendet, Escherichia coli – Bakterien welche mit dem Fluoreszenz-Protein („EosFP“) einer Koralle (Lobophyllia hemrichi) transfiziert worden sind. Dieser Fluoreszenzfarbstoff konvertiert durch Foto-Stimulation von einem grünen zu einem stark pH-abhängigen (<pH4) roten Farbstoff und kann damit die für intrazellulären Abbau hauptverantwortliche Fusion von Phagosom und Lysosom nachweisen. Der grüne Farbstoff selbst ist auch bei niedrigen pH-Werten stabil. Die Fluoreszenzbereiche sind denen etablierter Antikörpermarkierungen sehr ähnlich und lassen sich daher mit einer Anregungswellenlänge von 490nm und Emissionswellenlängenfiltern um 530nm und 570nm messen. Im Eos-FP E. coli-Phagozytosetest können folgende Parameter dokumentiert werden: 1. Phagozytoseleistung durch Anstieg der Grünfluoreszenz über die Zeit. 2. Abbauleistung durch Abnahme der Rotfluoreszenz über die Zeit. 3. Verhältnis von Grün-zu-Rotfluoreszenz über die Beziehung zwischen Phagozytoseleistung und Abbau.Vollblutproben wurden dazu mit den simultan rot und grün fluoreszierenden Bakterien inkubiert, so dass Zellen des Immunsystems diese phagozytieren konnten. Die Fluoreszenzintensität ist damit über die Zeit ein Maß für die Phagozytoseleistung pro Zelle (1). Die pH-Veränderungen mit konsekutivem Verlust der roten Fluoreszenz ermöglicht den Nachweis der Phagosomen-Lysosomen-Fusion und ist ein Maß für die Abbauleistung über die Zeit (2). Die Ratio von Grün zu Rot gibt einen Anhalt für das Verhältnis von Phagozytose zu Abbau. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Kontrollen und septischen bzw. Patienten im septischen Schock besteht darin, dass die Grünfluoreszenz über alle gemessene Zeitpunkte bei den Kontrollen deutlich weniger ansteigen als bei den Patienten. Das bedeutet, dass die Probanden in der Geschwindigkeit der Phagozytose reduziert sind, aber die Gesamtphagozytoseleistung bei allen Schockpatienten und bei etwa der Hälfte der Sepsispatienten deutlich stimuliert ist. Das könnte mit einer Ausreifung der meistens linksverschobenen Granulozytoenpopulation bei Sepsis erklärt werden. Die aktivierten Granulozyten von Patienten mit Sepsis weisen nach einer anfänglichen Verzögerung eine höhere Phagozytose - Aktivität auf, als gesunde Probanden. Zugleich konnten wir nun indirekt über die pH-Senkung den Eintritt in den Phagosomen-Lysosomen-Degradationskomplex messen. Dieser war zu jedem Inkubationszeitpunkt bei Patienten mit Sepsis signifikant höher, als bei gesunden Probanden. Die Daten zeigen demnach, dass Granulozyten von Patienten mit Sepsis schneller die phagozytierten Bakterien intrazellulär abbauen als gesunde Probanden. Aktuelle Studien über Phagozytose weisen gegenteilige Ergebnisse auf, unterscheiden sich jedoch deutlich von der Methodik (Inkubationszeit, Konzentration und Art des "target" sowie damit verbundenem Phagozytoseweg). In ergänzenden Einzelfall-Untersuchungen wurde die Wirkung von rhG-CSF (recombinant human granulocyte-colony-stimulating factor) auf Patienten mit Neutropenie und Sepsis anhand derselben Methodik ausgewertet. Die Veränderungen hierbei korrelieren mit einer Angleichung an die Ergebnisse gesunder Probanden. Der neuartige Assay ließ sich demnach auch als Verfahren erstmals standardisiert anwenden.