Biochemische Charakterisierung einer Rezeptorvariante des Protektiven Antigens von Bacillus anthracis zur Entwicklung eines Makrophagen/Monozyten-selektiven Transporters

Abstract

Bakterielle Exotoxine sind Ursache für eine Vielzahl von Erkrankungen wie z.B. Milzbrand oder Diphtherie. Diese Toxine bestehen aus zwei Komponenten: einer enzymatisch aktiven Komponente (A-Domäne) und einer Komponente für die Bindung an die Zellen und den Transport in das Zytosol (B-Domäne), weshalb man sie auch AB-Toxine nennt. Sie binden selektiv an Rezeptoren auf der Oberfläche ihrer Zielzellen und werden anschließend Rezeptor-vermittelt endozytiert. Die enzymatische Komponente modifiziert im Zytosol ihr spezifisches Substrat und bewirkt so Veränderungen der Zellmorphologie und des Zellstoffwechsels. Die Arbeitsgruppe Barth erforscht die Verwendung von AB-Toxinen als „Trojanische Pferde“ zum Einbringen von Molekülen in das Zytosol von Zellen in Hinblick auf einen späteren pharmakologischen Nutzen. Makrophagen/Monozyten sind an vielen Prozessen des Immunsystems beteiligt und auch bei Lungenkontusionen nach stumpfen Thoraxtrauma und Verbrennungen spielen sie eine wichtige Rolle. Dies macht sie als pharmakologisches Ziel sehr interessant. Das Toxin C3bot1 von C. botulinum wird selektiv von Makrophagen/Monozyten aufgenommen und bietet sich deshalb als Teil in einem Fusionsprotein für die Bildung eines Makrophagen-selektiven Transporters für Proteine an. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung und Charakterisierung der Protein-Chimäre mPA-C3bot1E174Q als ein möglicher Transporter für Proteine in Makrophagen/Monozyten. Diese Protein-Chimäre besteht aus dem enzymatisch inaktiven C3bot1-Toxin C3bot1E174Q für die Bindung an die Makrophagen/Monozyten und einer Rezeptorvariante von PA63 (B-Domäne) des Anthrax-Toxins. Durch die Einführung von Mutationen in PA63 wird die Bindung an die auf allen Zellen vorkommenden Anthraxrezeptoren verhindert, jedoch besitzt das mutierte PA63 (mPA) noch die Fähigkeit Poren in der Membran der frühen Endosomen auszubilden und ermöglicht so den Transport von Toxinen in das Zytosol der Zielzellen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte bewiesen werden, dass mPA-C3bot1E174Q selektiv das Toxin LFNDTA in die murinen Makrophagen/Monozyten-Zellen J774A.1 transportiert, jedoch in keine der anderen getesteten Epithelzelllinien (HeLa-, Vero-Zellen) oder Fibroblasten (CHO-K1-Zellen). Außerdem war es möglich das His6-markierte Toxin TccC3 über mPA-C3bot1E174Q in die murinen Makrophagen/Monozyten J774A.1 zu translozieren. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass mPA-C3bot1E174Q ein geeignetes Transportsystem für Makrophagen/Monozyten darstellt. Nachdem mPa-C3bot1E174Q in Anbetracht der Größe und Ladung der zu transportierenden Proteine weiter getestet und optimiert wurde, ist ein Einsatz in der Medizin als selektiver Transporter für Makrophagen/Monozyten in der Zukunft möglich. Hier könnte mPA-C3bot1E174Q bei Lungenkontusion nach stumpfen Thoraxtrauma seine Anwendung finden. Bei der Analyse der Bindung von mPA-C3bot1E174Q an die J774A.1-, HeLa-, Vero- und CHO-K1-Zellen ergaben sich Hinweise auf den Aufnahmemechanismus von C3-Toxinen. Es wurde eine basale Bindung von mPA-C3bot1E174Q an alle getesteten Zelltypen festgestellt, jedoch transportierte die Chimäre mPA-C3bot1E174Q nur Proteine in das Zytosol von Makrophagen/Monozyten. Dies könnte auf eine spezifische Membranbindung des C3bot1-Toxins an alle getesteten Zelltypen hindeuten und die Existenz eines nur auf Makrophagen/Monozyten befindlichen Rezeptors für die selektive Toxinaufnahme wahrscheinlich machen.