Die Rolle von p53 und dessen Isoformen beim rekombinations-assoziierten Bypass von Replikationsblockaden

Abstract

Der Tumorsuppressor p53 ist bekannt als Wächter des Genoms und er steuert über komplexe Signalwege Prozesse wie den Zellzyklus, die Apoptose und Seneszenz sowie die DNA-Reparatur und die Überwindung von DNA-Schäden mittels Bypassmechanismen. Ausgehend von der Entdeckung, dass p53 neben einem inhibitorischen auch einen stimulierenden Einfluss auf die homologe Rekombination (HR) ausüben kann, wurde kürzlich ein neuer Bypassmechanismus von Replikationsblockaden entschlüsselt. Dieser Bypass beinhaltet die Komplexbildung von p53 mit dem Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen (PCNA) und der Polymerase iota (POLι). Die p53-assoziierte Exonuklease und POLι generieren einen Leerlauf durch das Erweitern und anschließend sofortiges Verkürzen des DNA-Stranges um ein Nukleotid. Dies führt einerseits zur Stabilisierung der Replikationsgabel, andererseits wird das Fortschreiten der Replikation verlangsamt. Im nächsten Schritt kommt es vermittelt durch den Helikase-like-Transkriptionsfaktor (HLTF) und die Endonuklease und Translokase ZRANB3 (Zinc Finger RANBP2-Type Containing 3) zu einem Neustart der Replikation nach Beseitigung des Hindernisses. Neben dem vollständigen Wildtyp p53 (p53wt) gibt es weitere Isoformen des Proteins wie p53β und p53γ, die sich durch alternatives Splicen im C-Terminus unterscheiden und eine individuelle Funktion im Organismus und bei der Karzinogenese ausüben. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, den neu entdeckten Bypass von Replikationsblockaden durch p53 auf seine Funktionalität durch die p53-Isoformen p53β und p53γ näher zu untersuchen und hierbei insbesondere einen Blick auf die Interaktion mit den Bypass-Cofaktoren zu werfen. Bei der Analyse der Rekombinationsfrequenz zeigte sich, dass bekanntermaßen p53wt, jedoch weder p53β noch p53γ die Rekombination stimuliert. Bei der Untersuchung der Protein-Protein-Assoziationen mittels Proximity Ligation Assay (PLA) fand sich zunächst nur bei p53β eine zu p53wt annähernd gleichwertige Assoziation zu PCNA. Nach der zusätzlichen Behandlung mit dem DNA-Crosslinker Mitomycin C (MMC) zeigten beide Isoformen eine annähernd gleiche, aber im Vergleich zu p53wt reduzierte Assoziation. Im Bezug auf POLι war die Assoziation im PLA zu p53β bereits stark reduziert. Bei p53γ ließ sich keine Interaktion mit POLι mehr nachweisen. Daher kann man schlussfolgern, dass sowohl für die Steigerung der Rekombinationsfrequenz wie auch für die Interaktion mit den Bypass-Cofaktoren PCNA und POLι ein vollständiger C-Terminus benötigt wird. Genauer gesagt geht besonders durch den Verlust der dort enthaltenen Oligomerisierungsdomäne, die für die Tetramerisierung und damit für die DNA- und Protein-Bindung elementar ist, aber auch durch den Verlust der C-Terminus-Regulationsdomäne ein Teil der p53wt-Funktion verloren. Im DNA-Fiber-Spreading-Assay zeigte sich, dass nicht alle Abläufe im Bypass von Replikationsblockaden an p53wt mit intaktem C-Terminus geknüpft sind. Vor allem die Expression von p53γ führte zu einer DNA-Track-Verkürzung vergleichbar mit der von p53wt. Die Entstehung von verkürzten DNA-Tracks wurde bisher mit einer temporär unterbrochenen Replikation zur Initiierung des Bypasses erklärt. Da die Isoformen jedoch aufgrund ihrer C-Terminus-Variation nur noch fraglich mit PCNA und POLι interagieren, scheint hier möglichweise noch ein anderer Mechanismus bei der DNA-Track-Verkürzung zu agieren.