Die funktionelle Bedeutung der GLykosylierungsstellen an pUL74 des humanen Cytomegalovirus

Abstract

Nach einer meist subklinischen Primärinfektion persistiert das humane Cytomegalovirus (HCMV) lebenslang im Körper und kann unter Immunsuppression reaktiviert werden und schwerwiegende Krankheitsverläufe verursachen. In der Hülle von HCMV kommen unterschiedliche Glykoproteine vor, zu denen auch pUL74 zählt, das in einem trimeren Komplex zusammen mit gH und gL wichtig für den Eintritt in Zielzellen ist. Dieses hochpolymorphe Protein weist bei einem 54 kDa umfassenden Peptidgerüst etwa 65 kDa an N-Glykosylierung auf. Neben großem Einfluss auf Faltung und Stabilität von Proteinen ist für N-Glykosylierung viraler Proteine auch eine immunevasive Funktion bekannt. Die Funktion der Glykane an pUL74 war bislang unbekannt. Daher sollte in dieser Arbeit überprüft werden, ob die Glykane essentiell für die Integrität von pUL74 und dessen Funktion bei der Virusreplikation sind. Sollten sich die Glykane an pUL74 als nicht essentiell erweisen, könnte dieses mutierte Virus in der Impfstoffentwicklung eine Rolle spielen. Zunächst wurde eine Virusmutante generiert, in deren offenem Leserahmen UL74 alle vorhergesagten N- und O-Glykosylierungsstellen durch konservativen Austausch von Aminosäuren entfernt wurden. Diese Virusmutante (pUL74deglyc) wurde dann bezüglich Ausbreitung in der Zellkultur, zellfreier Infektiosität und Komplexbildung untersucht. Sowohl die Ausbreitungskapazität dieses pUL74deglyc-Virus in Fibroblasten, als auch die zellfreie Infektiosität von Fibroblasten war auf das Level einer pUL74stop-Mutante reduziert. Trotz entfernter Glykosylierungsstellen konnte pUL74 im Western Blot als einzelnes Protein auf der Höhe von ca. 60 kDa nachgewiesen werden, allerdings in deutlich reduzierter Menge. Ein trimerer Komplex mit gH und gL war jedoch bei der Mutante im Western Blot nicht nachweisbar. Glykosylierungsstellen in der Nähe von konservierten Cysteinen scheinen Einfluss auf die Ausbildung von Disulfidbrücken zu habe. Daher wurden in einem zweiten Ansatz alle O-Glykosylierungsstellen und vier N-Glykosylierungsstellen in der Nähe von Cysteinen, die bei der Bildung des trimeren Komplexes wichtig sind, wieder eingefügt. Mit zunehmender Glykosylierung war pUL74 im reduzierenden Western Blot wieder in höherer Menge nachweisbar. Der trimere Komplex konnte allerdings weiterhin nicht nachgewiesen werden, und entsprechend war die Infektiosität dieser Viren ebenso stark reduziert wie die des pUL74deglyc-Virus. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Glykosylierungsstellen an pUL74 wichtig für die Integrität des Proteins und die Ausbildung des trimeren Komplexes und damit auch für die Virusreplikation sind. In zukünftigen Studien könnten weitere Glykosylierungsstellen wieder eingefügt werden, bis auch der trimere Komplex wieder gebildet werden kann, um dann die Auswirkung der noch fehlenden Glykane auf die Immunogenität untersuchen zu können.