Phagozytose und Degradation von EosFP E.coli-Bakterien durch mononukleäre Zellen bei Intensivpatienten und gesunden Kontrollen

Abstract

Die Phagozytose und anschließende Abtötung von Pathogenen in Phagosomen bilden die Grundlage der angeborenen Immunabwehr. Das mononukleäre Phagozytensystem stellt eine Untergruppe der Leukozyten dar und schließt im Blut zirkulierende Monozyten, Gewebsmakrophagen sowie dendritische Zellen mit ein. Das Ziel dieser Arbeit lag in der Etablierung eines Phagozytoseassays, mit dem sich die Phagozytoseleistung sowie das Degradationsvermögen von mononukleären Zellen simultan messen lassen. Hierfür wurden mit EosFP (Eos Fluorescent Protein)-transfizierte E.coli (Escherichia coli)-Bakterien verwendet. EosFP ist ein photokonvertierbares Protein aus der Familie der grün fluoreszierenden Proteine. Bei einer Anregung mit 490 nm emittieren die transfizierten Bakterien grünes (516 nm) und rotes (581 nm) Fluoreszenzlicht. Da die rote Fluoreszenz nicht säurestabil ist, geht sie bei den phagozytierten Bakterien nach der Bildung des Phagolysosoms verloren. In der vorliegenden Arbeit wurden 42 Blutproben von Intensivpatienten, bei denen SIRS oder Sepsis vorlag, sowie 8 Blutproben von gesunden Spendern untersucht. Mittels Ficoll-Gradient wurden die mononukleären Zellen aus peripherem Blut isoliert und mit den EosFP E.coli-Bakterien inkubiert. Nach 1, 3, und 6 Stunden sowie nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen analysiert. Die Auswertung erfolgte anhand von Durchflusszytometrie und Mikroskopie. Anhand der grünen Fluoreszenz konnte die Phagozytoseleistung bestimmt werden. Darüber hinaus erkennt man an der Verminderung der roten Fluoreszenz, ob und wann die phagozytierten Bakterien im Phagolysosom verdaut werden. Die Unterschiede der Phagozytoseleistung zwischen den Intensivpatienten und den gesunden Kontrollen waren nicht signifikant. Mit dieser Studie konnte gezeigt werden, dass sich mit EosFP-transfizierte Bakterien für einen Phagozytoseassay mit mononukleären Zellen eignen, um gleichzeitig die Phagozytose- und Degradationsleistung zu bestimmen.