Charakterisierung der Clostridium difficile Transferase b an kultivierten Säugetierzellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Eigenschaften der bindenden Untereinheit der Clostridium difficile Transferase (CDTb) auf Säugetierzellen untersucht. Bei der Clostridium difficile Transferase (CDT) handelt es sich um ein binäres Toxin, welches aus einer enzymatischen (CDTa) und der untersuchten bindenden Untereinheit (CDTb) gebildet wird. Es gehört zur Familie der Iota-ähnlichen Toxine und überträgt ADP-Ribosylgruppen auf Aktin.

Im ersten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass CDTb einen eigenständigen, zelltypspezifischen und zu CDT verschiedenen zytotoxischen Effekt aufweist. CDTb führt nach ca. einer halben Stunde zu einer progredienten Abrundung von Vero-Zellen. Dieser Effekt erreicht nach ungefähr zwei Stunden seine maximale Ausprägung. Je nach genutzter Toxinkonzentration ist dieser Effekt anschließend reversibel, sodass die Zellen in ihre ursprüngliche Morphologie zurückkehren können. Bei höheren Dosierungen des Toxins kommt es jedoch nur zu einer partiellen Rückbildung. Auch MTS-Assay, zur farblichen Messung der Zellvitalität, konnte dieser reversible Effekt bestätigt werden. In den ersten zwei Stunden ist jedoch optisch keine Differenzierung zwischen vitalen und irreversibel geschädigten Zellen möglich. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass es zu anhaltenden Veränderungen der sensitiven Zellen kommt, welche auch nach einer Generationszeit noch nachweisbar sind. Diese einmalig behandelten Zellen sind durch unbekannte Widerstandsfaktoren vor einer erneuten Inkubation mit dem Toxin geschützt.

Im zweiten Teil konnten deutliche Hinweise für den Mechanismus des zytotoxischen Effektes gefunden werden: diverse Porenporenblocker, sowohl für das Gesamttoxin CDT als auch anderer iota-like Toxine, führten zu einer deutlichen Reduktion des Morphologie verändernden Effektes durch CDTb. Da CDTb beim Gesamttoxin eine Pore für den Transport von CDTa in die Zielzelle ausbildet und der Effekt durch gängige Porenblocker inhibiert werden kann, handelt es sich bei CDTb am ehesten um ein porenbildendes Toxin.