Interaktion des Pertussistoxins mit dem Chaperon Hsp90 und Peptidyl-prolyl-cis/trans-Isomerasen während seiner Aufnahme in Säugetierzellen

Abstract

Das Pertussistoxin ist ein AB5-Exotoxin, das von Bordetella pertussis produziert und sezerniert wird und den Auslöser der Infektionskrankheit Pertussis (Keuchhusten) darstellt. Es besteht aus einem A-Protomer, das der S1-Untereinheit entspricht und die Enzymfunktion trägt, und einem B-Oligomer, das aus den Untereinheiten S2, S3, 2 x S4 und S5 besteht und für die Bindung des Toxins an seine Zielzellen und die Translokation des A-Protomers aus dem endoplasmatischen Retikulum in das Zytosol der Zielzellen zuständig ist. Zu seinem Translokationsort gelangt Pertussistoxin als long-trip Toxin nach der Rezeptor-vermittelten Endozytose und dem retrograden Transport durch den Golgi-Apparat. Die Enzymfunktion des A-Protomers besteht in einer Adenosindiphosphat-(ADP)-Ribosyltransferase, welche im Zytosol die kovalente Übertragung von ADP-Ribose-Resten auf die α-Untereinheiten von membrangebundenen inhibitorischen heterotrimeren (Gi/o)-Proteinen katalysiert. Dadurch wird in Zellen die Hemmung der Adenylatzyklase aufgehoben, welche konsekutiv vermehrt zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) herstellt. Dies führt zu unterschiedlichen Reaktionen auf Pertussistoxin sowohl auf zellulärer als auch auf systemischer Ebene.

In der Arbeitsgruppe Barth werden die molekularen Aufnahmemechanismen bakterieller AB-Toxine sowie die Beteiligung von zytosolischen Wirtszellfaktoren an der Translokation der A-Untereinheiten untersucht. Dadurch konnte die Arbeitsgruppe erstmals zeigen, dass das Chaperon Hitzeschockprotein90 (Hsp90) und die Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) der Cyclophilin- und der FK506-Bindeprotein-Familien wichtige Rollen bei der Translokation einiger clostridialer Toxine und des Diphtherietoxins spielen, bei denen es sich ebenfalls um ADP-Ribosyltransferasen handelt.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von Hsp90 und der PPIasen bei der zellulären Aufnahme des Pertussistoxins zu charakterisieren. Dafür wurde die Wirkung der spezifischen pharmakologischen Inhibitoren Radicicol, das Hsp90 hemmt, Cyclosporin A, das Cyclophiline hemmt, und Tacrolimus (FK506), das FK506-Bindeproteine hemmt, auf die Vergiftung von Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) durch Pertussistoxin genauer betrachtet, um zu prüfen, ob die Wirtszellfaktoren an der Toxinaufnahme beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit konnte dabei erstmals gezeigt werden, dass Radicicol, Cyclosporin A und FK506 die Vergiftung kultivierter CHO-Zellen durch Pertussistoxin deutlich verzögerten, ebenso das nicht-immunsuppressive Cyclosporin A Derivat VK112. Um die Hypothese, dass dabei die Translokation inhibiert wird, zu bestätigen, wurden weitere Experimente durchgeführt, um die Hemmung genauer zu charakterisieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass weder die Bindung des Toxins an zelluläre Rezeptoren noch seine Enzymaktivität durch die Inhibitoren gehemmt wurden. Die Inhibitoren führten dazu, dass in den Zellen weniger Substrat Giα von Pertussistoxin ADP-ribosyliert wurde, da weniger des A-Protomers des Toxins im Zytosol angekommen war. In Zusammenschau mit den vorgenannten Ergebnissen ist dies ist ein sehr starker Hinweis darauf, dass die zytosolischen Faktoren an der Translokation des A-Protomers ins Zytosol beteiligt sind. Somit konnte erstmals die Beteiligung von Hsp90, Cyclophilinen – sehr wahrscheinlich von Cyclophilin A – und FK506-Bindeproteinen an der Aufnahme von Pertussistoxin ins Zytosol aufgezeigt werden, was einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis seines Aufnahmemechanismus in Säugetierzellen leistet. Überdies haben die Ergebnisse, insbesondere die des nicht-immunsuppressiven Cyclosporin A Derivats VK112, eine medizinisch-klinische Relevanz, da sie zeigen, dass dieser Inhibitor zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Entwicklung neuartiger, möglicherweise sogar kausaler, Therapiestrategien zur Behandlung von durch Pertussistoxin verursachten Erkrankungen werden könnte. Die vorliegende Arbeit liefert somit Grundlagen und Anregungen für weitere, vielfältige Versuche zukünftiger Arbeiten, wie die Analyse der Interaktion der einzelnen zytosolischen Faktoren mit Pertussistoxin in vitro und in lebenden Zellen.