Veränderungen des Membranpotentials von neutrophilen Granulozyten durch das Komplementaktivierungsprodukt C5a

Abstract

Das Immunsystem schützt den Körper, wobei eine genaue Äquilibrierung der beteiligten Mediatoren, Zellen und Organsysteme unabdingbar ist. Beim angeborenen Immunsystem kommt der Aktivierung von neutrophilen Granulozyten durch Warnsignale wie dem Komplementaktivierungsprodukt C5a eine besondere Bedeutung zu. Im Falle einer ausgeprägten inflammatorischen Reaktion des Körpers wie beispielsweise im Rahmen von Sepsis oder hämorrhagischem Schock führt eine Aktivierung von unterschiedlichen Signaltransduktionskaskaden zu einer Lähmung der neutrophilen Granulozyten. Vorbeschrieben sind hierbei Kalziumeinstrom, eine transiente Alkalinisierung und eine Formveränderung. Hiervon leitete sich die Hypothese ab, dass C5a auch das zelluläre Membranpotential von neutrophilen Granulozyten verändert.

Um diese elektrophysiologischen Änderungen zu messen, wurde in dieser Arbeit eine durchflusszytometrische Methode an neutrophilen Granulozyten etabliert sowie validiert, da sonst gängige Messmethoden wie die „Patch-Clamp“-Technik an diesen Zellen nicht oder nur mit Limitationen anwendbar sind. Darüber hinaus wurden weitere elektrophysiologische Zellparameter wie der intrazelluläre pH-Wert und das mitochondriale Membranpotential untersucht. Für das Untersuchen der Abhängigkeit vom intrazellulären pH wurde eigens eine Doppelfärbung mit den Farbstoffen DiBAC4(3) bzw. SNARF entwickelt. Für die so entwickelte Methode zur Messung des Membranpotentials wurden Zellen freiwilliger, gesunder, menschlicher Probanden sowie Zellen entnommen aus einem Modell porkinen hämorrhagischen Schocks.

Als Ergebnis zeigte sich, dass neutrophile Granulozyten bei gesunden Spendern mit einer Depolarisation von rund 5 mV auf eine Stimulation durch C5a 100 ng / ml nach einer Minute reagierten, wobei diese Depolarisation nach zehn Minuten stark rückläufig war. Das mitochondriale Membranpotential veränderte sich durch C5a nicht. Die Depolarisation lässt sich dabei durch den Austausch extrazellulärer Ionen nicht verändern, jedoch nimmt sie zu mit sinkendem extrazellulärem pH-Wert. Im hämorrhagischen Schock an Schweinen konnte die C5a-induzierte Depolarisation bei gesunden Schweinen nachvollzogen werden, jedoch nicht mehr nach der dreistündigen Schockphase. Hier waren die neutrophilen Granulozyten auf C5a elektrophysiologisch nahezu reaktionslos.

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass C5a eine Veränderung des Membranpotentials im Sinne einer Depolarisation bewirkt, diese jedoch unter ausgeprägter systemischer Aktivierung des Immunsystems aufgehoben ist. Zukünftig bleibt zu klären, ob die vorhandene bzw. nicht vorhandene Veränderung des Membranpotentials Auswirkungen auf die Zellphysiologie der neutrophilen Granulozyten hat. Die entwickelte Methode eignet sich zu Charakterisierungen weiterer Zellen wie beispielsweise von Makrophagen oder weiterer Stimulantien, welche ebenso zur Immundysfunktion von neutrophilen Granulozyten bei entsprechenden Krankheiten beitragen könnten.