Etablierung des neuartigen Gewebeclearing-Verfahrens CLARITY zur Verbesserung der Immunmarkierung in der Elektronenmikroskopie

Abstract

Die Untersuchung von Gewebe ist eine der wichtigsten Voraussetzungen für die Erforschung humaner Pathologien. Durch die Entwicklung der ersten Mikroskope vor ca. 300 Jahren ist es Wissenschaftlern möglich, Zellen und ihre kleinsten Strukturen, darunter Organellen und Proteine, zu analysieren. Physikalische Effekte wie Streuung, Reflexion oder Absorption erschweren die Gewebeuntersuchung jedoch erheblich. Hauptsächlich dafür verantwortlich sind die Biomembranen, die die Penetranz von Molekülen (Immunmarkierung) verhindern und Licht während der Mikroskopie streuen, was Unschärfe und Trübung zur Folge hat. Eine der erfolgreichsten Techniken der letzten Jahre, um Gewebe zu fixieren und für optische Aufnahmen vorzubereiten, ist das Gewebeclearing-Verfahren CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Anatomically Rigid, Imaging/immunostaining compatible, Tissue hYdrogel). Im Zentrum dieser Promotionsarbeit steht die Etablierung und die Verbesserung von CLARITY sowie die Kombination mit der Immuno-Elektronenmikroskopie (Immuno-EM). Zunächst wurde hierfür das passive Clearing optimiert und umgesetzt. Mit der Entwicklung einer Elektrophoresekammer konnte das Verfahren beschleunigt und damit verbessert werden. CLARITY steigert zudem die Permeablität des Gewebes für Antikörper und ermöglichte damit die Darstellung cerebellärer Synapsen in einem 100 µm dicken Mausgehirnschnitt. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde versucht, die Vorteile von CLARITY wie bessere Antikörper-Penetration und Anstieg der Immunogenität mit denen der Elektronenmikroskopie wie hohe Auflösung und Detailansicht der Ultrastruktur zu kombinieren. Zunächst konnte gezeigt werden, dass Gewebe nach Behandlung mit CLARITY generell mit dem Elektronenmikroskop dargestellt werden kann. Proteindichte Strukturen und Organellen konnten gut erhalten werden, bei gleichzeitigem Verlust der Biomembranen und Lipiden. Im nächsten Schritt wurden zwei Immunmarkierungsverfahren getestet: 1.) Die 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Kontrastierung und 2.) die Immunogold-Markierung. Für ersteres Verfahren wurden zunächst verschiedene Hirnregionen u.a. der Hippocampus, das Cerebellum und das Striatum sowie unterschiedliche synaptische Antikörper gegen Synaptophysin, SHANK2 und SHANK3 getestet. Zur Auswertung der DAB-Reaktion wurde eine quantitative Analyse angewandt und zur Bestätigung der Immunogold-Markierung genügte ein positiver Nachweis der Gold-Kolloid-Partikel in der postsynaptischen Dichte. Methoden wie die Immunhistochemie oder die Darstellung kleinster Strukturen mit Hilfe der Elektronenmikroskopie haben eine große Bedeutung bei der Erforschung humaner Pathologien. Allen voran Erkrankungen an der Synapse wie beispielsweise Autismus-Spektrum-Störungen. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zur Fusion bewährter Methoden mit neuartigen Verfahren.