Transfer-RNAs mit Intron und ihre Reifung durch die tRNA-Spleiß-Endonuklease in Spalthefe

Abstract

Im Unterschied zu höheren Eukaryoten, die nur wenige tRNA-Introns besitzen, sind in Schizosaccharomyces pombe zahlreiche kernkodierte Transfer-RNAs durch Introns unterbrochen. Die meisten Introns in prä-tRNAs aus Spalthefe sind verhältnismäßig kurz. Um die Reifung von tRNA-Vorläufern in S. pombe zu untersuchen, wurde ein in vitro-Prozessierungssystem etabliert. Dazu wurde ein Spalthefe Kernextrakt hergestellt, der in der Lage ist, homologe, in vitro-transkribierte tRNA-Vorläufer zu prozessieren. Vier Intron-enthaltende tRNA-Substrate aus S. pombe konnten in diesem Extrakt gespleißt werden. Bisher wurde angenommen, daß Vorläufer-tRNAs in Eukaryoten nur an der maturen tRNA-Domäne von der Intron-entfernenden Aktivität erkannt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen hingegen, daß auch Mutationen innerhalb der Intron-Sequenz Auswirkungen auf das Intron-Spleißen haben können. Das Enzym in S. pombe toleriert jedoch eine größere Intron-Variabilität als die tRNA-Spleiß-Endonukleasen in anderen Organismen. Die tRNA-Spleiß-Endonuklease aus Spalthefe besitzt ein breites Substratspektrum, da auch heterologe tRNA-Vorläufer aus anderen Eukaryoten prozessiert werden. Intron-enthaltende prä-tRNAs aus dem Archaeon Haloferax volcanii wurden jedoch im S. pombe Kernextrakt nicht geschnitten, da eukaryotische tRNA-Spleiß-Endonukleasen andere Substratmerkmale erkennen als die archaealen Enzyme. Zwei Protein-Sequenzen, die in offenen Leserastern von S. pombe kodiert sind, besitzen hohe Ähnlichkeiten zu Untereinheiten der tRNA-Spleiß-Endonuklease in S. cerevisiae. Eine davon (sp34) ist zu einer katalytisch aktiven Untereinheit des Bäckerhefe-Enzyms ähnlich. Um zu analysieren, ob das Protein der Spalthefe auch als Intron-entfernende Untereinheit fungiert, wurde ein gene disruption Experiment durchgeführt. Die Untersuchung der erzeugten Mutante ergab, daß sp34 für das Überleben der Spalthefezellen essentiell ist. Sequenzvergleiche mit anderen tRNA-Spleiß-Endonukleasen zeigen, daß sp34 die konservierten Aminosäuren enthält, die wahrscheinlich das aktive Zentrum des Enzyms darstellen. Dies deutet darauf hin, daß es sich tatsächlich um eine Untereinheit der tRNA-Spleiß-Endonuklease handelt.