Partielle Aufreinigung der RNase P aus Kartoffelmitochondrien

Abstract

Die Aufreinigung der RNase P, des 5(Strich)-prozessierenden Enzyms der tRNA-Reifung, wurde ausgehend vom schon bestehenden Schema der partiellen Aufreinigung (Marchfelder und Brennicke 1994) fortgesetzt. Die Salzfällung kombiniert mit der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie führt zur Abtrennung eines großen Teils des Proteins. Dabei wird ein Protein P80 (ca. 80 kd) angereichert, das im Vergleich mit den Proteingelen anderer Reinigungsschritte jedoch nicht eindeutig mit der Aktivität korreliert. Bei der Gelfiltration eluiert die RNase P im Bereich von 90 kd. Bei Auftrag einer größeren Proteinmenge ließ sich die Aktivität auch in Fraktionen mit höherer Molekülgröße beobachten. Diese Streuung der RNase P ist ein Problem der Trennung nach Größe und Form, aber auch bei adsorptiven Reinigungsschritten wie der Bluesäule. Durch die Chromatofokussierung läßt sich der pI der RNase P mit den diskutierten Einschränkungen im Bereich von pH 8-9 festlegen.

Die Identifizierung des Gens durch die Hybridisierung gegen das sequenzierte Chondriom von Arabidopsis thaliana ist an dem hohen Gehalt an verschiedenen RNAs gescheitert. tRNAs und sogar mRNAs sind möglicherweise an Ribosomen gebunden über Anionen- und Kationenaustauscher mit aufgereinigt worden und ihre Hybridisierungssignale machen es unmöglich, das Fragment mit der RNase P RNA zu identifizieren. Die Mitaufreinigung von vermutlich vor allem ribosomaler RNA aller Größen hat auch die Direktsequenzierung der RNA-Untereinheit der RNase P vereitelt. In den aus den Gelen für die Sequenzierung eluierten Banden ist ein Gemisch verschiedener RNAs enthalten, die das Auslesen einer Sequenz unmöglich macht. Die Mitaufreinigung der ribosomalen RNAs erschwert es, das Gen der RNase P RNA durch Koloniehybridisierung zu identifzieren, weil dabei zu erwarten wäre, daß vor allem Klone mit den Genen dieser RNAs identifiziert werden. Aus diesem Grund wurde geprüft, ob diese Signale durch den Einsatz von Nukleinsäuren mit ribosomalen Sequenzen unterdrückt werden können. Für die 18S rRNA wurde gezeigt, daß der Einsatz unmarkierter RNA am besten geeignet ist und so wurden die rRNAs von PCR-Fragmenten transkribiert, um in weiteren Experimenten zur Abdeckung der entsprechenden Gene eingesetzt zu werden.