Immunhistologische Untersuchungen zum Einfluss eines Anti-Midkine-Antikörpers auf die murine Frakturheilung

Abstract

Wir untersuchten in der vorliegenden Arbeit anhand eines etablierten murinen Frakturheilungsmodells den Einfluss eines Anti-Midkine-Antikörpers (Anti-MDK- AK) auf die Frakturheilung. Dazu wurde in einem standardisierten Operationsverfahrens der zunächst osteosynthetisch stabilisierten Femurschaft osteotomiert. Die Tiere wurden in zwei Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe erhielt lediglich phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) und die andere PBS mit dem Anti- MDK Antikörper in einem festen Schema subcutan injiziert. Anhand immunhistologischer Färbungen konnten wir zeigen, dass bei den mit Anti-MDK-AK behandelten Tieren weniger extrazelluläres Midkine (MDK) im periostalen Kallus am 4. und ebenso am 10. post-operativen Tag auftrat. Weiterhin bestätigen unsere Untersuchungen die Erkenntnisse vorangegangener Studien zur zeitlichen und örtlichen Expression von MDK während der Frakturheilung, indem wir am Tag 4 vereinzelt MDK im periostalen frakturnahen Bereich in spindelförmigen Zellen, am Tag 10 viel MDK in den hypertrophen Chondrozyten des Kallus und am Tag 21 ein abnehmendes MDK nachwiesen. Bei den untersuchten Mineralisationsproteinen Dentin Matrix Protein-1 (DMP-1) und ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP-1), die durch MDK induziert werden können, zeigte sich bei DMP-1 in der AK-Gruppe eine tendenziell größere DMP-1 positive Fläche als in der Kontroll-Gruppe, was vermutlich auf den größeren Frakturkallus mit einer vermehrten Anzahl an osteoblastärer Zellen zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigten sich keine Unterschiede in der histologischen Darstellung zwischen den Vergleichsgruppen. Die immunhistologische Färbung Neutrophiler Granulozyten und Macrophagen zeigte keine statistisch signifikanten Ergebnisse, jedoch konnten bei der AK- Gruppe tendenziell eine geringere Anzahl an Neutrophilen Granulozyten am Tag 4 post-operativ, sowie ein tendenziell verzögerter Anstieg der Macrophagen-Anzahl während der Frakturheilung bei der AK-Gruppe beobachtet werden. Unsere Erkenntnisse legen den Schluss nahe, dass der Anti-MDK-AK zwar das extrazelluläre MDK beeinflusst, jedoch keinen Einfluss auf das intrazelluläre Auftreten von MDK hat. Beobachtungen der inflammatorischen Zellen könnten auf eine Beeinflussung dieser Zellen durch die Antagonisierung von extrazellulärem MDK durch die Anti-MDK-AK hindeuten. In unserer Arbeitsgruppe zeigte die AK-Gruppe am Tag 21 mehr Knochen im Kallus. Darüber hinaus war das Kallusvolumen in dieser Gruppe am Tag 28 kleiner als in der Kontroll-Gruppe. Führt man diese Ergebnisse zusammen deutet dies darauf hin, dass schon alleine die Beeinflussung des extrazellulären MDK durch den Antikörper zu einem starken Kallus mit schnellem Kallus-Remodeling führt. Deshalb ist ein therapeutischer Einsatz des Anti-MDK-AK zur Unterstützung der Frakturheilung durch die gezielte Antagonisierung von MDK bei schwer zu versorgenden Frakturen vorstellbar.