Herstellung rekombinanter Clostridien-Sporen zur Therapie nekrotisierender Tumore

Abstract

In dieser Arbeit sollte Clostridium acetobutylicum genetisch so modifiziert werden, dass der Organismus für eine Tumor-Therapie verwendet werden kann. Ein eukaryotisches Cytochrom-P450-Enzym sollte exprimiert werden und die Arzneimittelvorstufen Ifosfamid und Cyclophosphamid sollten in ihre aktiven Formen überführt werden. Das Gen cyp2BI aus Rattus norvegicus wurde in Escherichia coli und Clostridium acetobutylicum exprimiert. In Western-Transfer-Experimenten konnte das entsprechende Protein in beiden genetisch veränderten Organismen nachgewiesen werden. In Enzym-Tests mit Proteinfraktionen beider Organismen konnte aber keine Aktivität des rekombinanten Proteins gemessen werden. In einem weiteren Ansatz wurde das Clostridium perfringens-Enterotoxin (CPE) erfolgreich in C. acetobutylicum exprimiert. Das cpe-Gen wurde mit der Signalpeptid-codierenden-Sequenz der amyP aus C. acetobutylicum fusioniert. Das dadurch resultierende Fusionsprotein wurde ausgeschleust und konnte im Überstand der Kulturen in einer Konzentration von 0,5 mg/l nachgewiesen werden. In Cytotoxizitäts-Tests mit humanen Pankreaskarzinomzellen der Zelllinie CAPAN1 zeigte das rekombinante CPE aus C. acetobutylicum p7BIG2TOX Klon C6 eine toxische Wirkung. Bei Tierversuchen mit steril gezüchteten "NMRI nu/nu"-Mäusen, die CAPAN1 Tumore trugen, wurden Sporen von C. acetobutylicum p7BIG2TOX Klon C6 injiziert. Im Gegensatz zu in vitro-Versuchen konnte hierbei aber keine CPE-Wirkung nachgewiesen werden. Vermutlich war die sezernierte Dosis für eine Wirkung auf die Tumore zu gering. In weiteren versuchen konnte gezeigt werden, dass rekombinantes C. acetobutylicum Spo0A in seiner phosphorylierten Form Spo0A-P an Gen-Abschnitten des 5"-regulatorischen Bereichs des cpe-Gens aus C. perfringens binden kann. Bei Untersuchungen des Genoms von C. acetobutylicum wurde ein potentielles Cytochrom-P450-Gen entdeckt, sowie Gene für eine potentielle ADP-Ribosyltransferase und eine potentielle ADP-Glycohydrolase.