Validierung eines Short Tandem Repeat-basierten Analyseverfahrens mittels Massively Parallel Sequencing zur Identifizierung forensischer Proben

Abstract

Für die forensische Molekulargenetik hat sich Massively Parallel Sequencing (MPS) bereits als hilfreiches Werkzeug erwiesen. Mittels dieser Technologie können nicht nur zahlreiche forensisch-relevante Marker innerhalb eines Analysenlaufs, sondern zugleich für mehrere Proben parallel untersucht werden. Dies führt insgesamt zu geringeren Kosten pro analysierter Probe im Vergleich zur Kombination herkömmlich verwendeter Routineverfahren. Die forensische DNA-Typisierung auf Basis der Kapillarelektrophorese (engl.: Capillary Electrophoresis, CE) ist gegenwärtig die meistgenutzt Methode in forensisch-genetischen Routinelaboren, obwohl sie hinsichtlich Auflösung, Skalierbarkeit und Probendurchsatz limitiert ist. Im Vergleich zur CE bietet MPS eine wesentlich höhere genetische Trennschärfe, da Allele nicht nur anhand der Anzahl ihrer Wiederholungseinheiten, sondern zusätzlich aufgrund der basengenauen Nukleotidsequenz der STR-Abschnitte identifiziert werden. Dadurch können nicht zuletzt komplexe Mischprofile erfolgversprechender dekonvolviert werden. Das forensische MPS-Multiplexpanel monSTR wurde für die gezielte, hochauflösende STR-Typisierung auf der Illumina MiSeq-Plattform entwickelt und amplifiziert die wichtigsten STR-Kernloci des European Standard Sets (ESS) sowie das hochinformative System SE33. Darüber hinaus stellt es eine kostengünstige und dennoch wettbewerbsfähige Alternative zu kommerziell erhältlichen MPS-Panels dar. Für die Library-Preparation wurde eine amplikonbasierte Strategie gewählt, die sich auf die Sequenzierung spezifischer Zielregionen (Amplikons) konzentriert. Ziel der in der vorliegenden Dissertation beschriebenen Arbeiten war die umfassende Validierung von monSTR auf Grundlage der forensisch wesentlichen Richtlinien der Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM). Für diesen Zweck wurden experimentelle Studien zu insgesamt sechs Qualitätsaspekten (Konkordanz, Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit, Sensitivität, die Analyse unterschiedlicher Mischungsverhältnisse, die Untersuchung forensischer Ringversuchsproben und Speziesspezifität) geplant und durchgeführt, um die Robustheit und analytische Grenzen des Multiplexpanels umfassend zu bewerten. Die Leistungsfähigkeit wurde anhand der statistischen Parameter Allele Coverage Ratio (ACR), Coverage coefficient of variation (CV), Calling Ratio (CR), Signal to Noise Ratio (SN) und Minor Component Allele Frequency (MAF) bewertet. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die genetischen Profile der untersuchten Referenz- und Ringversuchsproben eine nahezu vollständige Konkordanz zu den mittels CE bestimmten Genotypen aufweisen. Innerhalb der Intra- und Inter-Run Experimente wurde eine hohe Präzision sowohl zwischen unterschiedlichen MPS-Läufen als auch innerhalb derselben Sequenzierläufe festgestellt. Vollständige STR-Profile, eine ausgeglichene Interlokus-Balance und ein gutes CR-Verhältnis konnten mit DNA-Inputmengen ab 62,5 pg DNA im Rahmen der Sensitivitätsstudie erhalten werden. Gleichzeitig wurden insgesamt 76,4 % der Allele bei einer DNA-Inputmenge von 7,8 pg erfolgreich typisiert. Die Analyse unterschiedlicher DNA-Mischungsverhältnisse zeigte, dass 94,4 % der Allele der Nebenkomponente innerhalb der 1:49-Mischung korrekt zugeordnet wurden. Zudem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der tatsächliche Anteil der Nebenkomponente auf der Grundlage der minor allele frequency genau berechnet werden konnte. Bei der Prüfung auf Speziesspezifität der Methode resultierten keine signifikanten Signale bei Untersuchung der DNA verschiedener verbreiteter Tierarten (Hund, Katze und Pferd). Die zuvor beschriebenen Validierungsergebnisse veranschaulichen, dass das forensische Multiplexpanel monSTR ein valides Analyseverfahren für die forensische STR-Genotypisierung mittels Massive Parallel Sequencing darstellt. Begründet durch die im Rahmen dieser Validierung aufgezeigten Grenzen der Methode, die zukünftig einige Modifikationen erforderlich machen, sollte der Arbeitsablauf für die tägliche forensische Laborroutine in nachfolgenden Forschungsarbeiten weiter optimiert werden. Gleichzeitig sollen neue Sequenzierplattformen, wie beispielsweise die Long-Read-Sequenziertechnologie mittels Nanopore, auf die Library-Preparation mittels monSTR adaptiert werden.