Die tRNase Z-Enzymfamilie: in vivo- und in vitro-Studien

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und Funktion sowohl der kurzen als auch der langen tRNase Z-Proteine untersucht. Ein Schwerpunkt lag in der in vivo- und in vitro-Charakterisierung der essentiellen langen tRNase Z aus S. cerevisiae. Zu Beginn der Arbeit war bekannt, dass die lebensnotwendige Funktion des Enzyms weder in der 3´-Prozessierung der nukleären Vorläufer-tRNAs noch in der Reifung der mitochondrialen prä-tRNAs liegt. Um die essentielle biologische Funktion von SceTrz herauszufinden, wurden eine SceTrz-Mutantenbank hergestellt und temperatursensitive Mutanten identifiziert. In vitro wurde gezeigt, dass SceTrz als Monomer vorliegt und sowohl homologe als auch heterologe Vorläufer-tRNAs direkt 3´ zum Diskriminator schneidet. Der zweite Schwerpunkt lag auf der Untersuchung des kurzen AthTrzS1-Enzyms, eines von vier tRNase Z-Proteinen aus A. thaliana. In dieser Arbeit wurden fünf Aminosäuren identifiziert, die für die Dimerisierung des Proteins notwendig sind. AthTrzS1 besitzt eine konservierte Phosphodiesterase (PDE)-Domäne wie alle tRNase Z-Proteine und kann die beiden Phosphodiester bpNPP und TpNPP umsetzen. Für die katalytische Aktivität des Enzyms sind Metalle erforderlich. Zusätzlich zu AthTrzS1 wurden eine Reihe weiterer tRNase Z-Proteine auf Phosphodiesteraseaktivität untersucht. Für einige tRNase Z-Proteine wurden die kinetischen Parameter bezüglich ihrer PDE-Aktivität bestimmt. Keines der bisher analysierten langen tRNase Z-Proteine weist Phosphodiesteraseaktivität auf. Quantitative Messungen zeigen, dass eine hohe tRNA-3´-Prozessierungsaktivität nicht mit einer hohen Phosphodiesteraseaktivität einhergeht. In einem dritten Projekt wurde nachgewiesen, dass das potentiell chloroplastidäre tRNase Z-Enzym aus A. thaliana (AthTrzS2) das dicistronische cptRNAMet-snmRNA-Transkript prozessiert. Alle tRNase Z-Enzyme besitzen eine Exosite. Am Beispiel der E. coli tRNase Z (EcoTrz) wurde gezeigt, dass dieses Modul für die Substraterkennung wichtig ist.