Untersuchung des funktionellen Einflusses von SHANK 2/3 auf die Osteoblastendifferenzierung und den adoleszenten Knochenstoffwechsel

Abstract

Bezüglich der medikamentösen Therapie der Osteoporose besteht ein immenser Forschungsbedarf. In einer Fluoreszenzmikroskopie basierten high content-Analyse im Institut für molekulare Endokrinologie der Tiere der Universität Ulm wurde zur Detektion neuer osteoanaboler Therapieansätze Shank 2/3 als potenzieller Aktivator der Differenzierung knochenbildender Osteoblasten ermittelt. Die SHANK-Proteine (SHANK 1, SHANK 2 und SHANK3) sind bisher vor allem bekannt durch ihre Gerüstfunktion für Protein-Protein-Interkationen in der postsynaptischen Dichte exzitatorischer Neurone. Weiterhin ist eine Haploinsuffizienz von SHANK-Genen assoziiert mit der Autismus-Spektrum-Störung. Der Einfluss von SHANK auf den Knochenstoffwechsel ist bislang noch nicht erforscht. Ein erster Hinweis auf einen Zusammenhang von SHANK mit dem Knochenstoffwechsel könnte das häufige Auftreten von kraniofaziale Dysmorphien bei Shank 3-Haploinsuffizienz in Phelan McDermid Patienten sein. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es den Einfluss von SHANK 2 und SHANK 3 auf die Osteoblastendifferenzierung und auf den Knochenstoffwechsel in männlichen und weiblichen Mäusen zu untersuchen. Durchgeführte in vitro-Funktionsverlustexperimente von Shank in zwei Zellsystemen ergaben, dass sowohl SHANK 2 als auch SHANK 3 an der Osteoblastendifferenzierung beteiligt sind. Dies zeigte sich anhand einer reduzierten Alkalischen Phosphatase (ALP)-Aktivität und einer reduzierten Mineralisierungskapazität mittels zellbiologischer Färbungen nach small interfering Ribonukleinsäure (siRNA)- Einsatz. Ebenso führte ein Funktionsverlust von SHANK zu einer transient reduzierten Genexpression der osteogenen Marker Runt-related transcription factor 2 und Osteokalzin in vitro. Eine Beeinflussung der Zellproliferation, Zellmenge und Zellvitalität durch SHANK 2- und SHANK 3-Funktionsverlust konnte durch einen Bromdesoxyuridin (BrdU) -Assay, eine Presto-Blue-Färbung sowie eine Kristall-Violett-Färbung ausgeschlossen werden. In einem murinen Modellsystem wurden männliche und weibliche Mäuse mit konditionalem Shank 2/3 Verlust in Osteoblasten (Shank2/3 Runx2Cre) im Alter von acht und 13 Wochen mittels Mikro-Computertomographie, Knochenhistologie, biomechanischer Testung und Serumumbaumarkern auf Veränderungen der Knochenmasse, Knochenzellzahl, Knochenqualität und den Knochenumbau untersucht. Hier zeigte sich, dass ein konditionaler Verlust von Shank 2/3 in Osteoblasten geschlechtsabhängig nur in weiblichen Mäusen und nur im Alter von acht Wochen zu einer signifikant reduzierten trabekuläre Knochenmasse von Femur und Wirbelkörper führt. In der weiteren Entwicklung war dieser Unterschied zwischen den weiblichen Genotypen weitgehend aufgehoben. Bei männlichen Mäusen wurde kein Unterschied der Knochenmasse zwischen den Genotypen für beide Zeitpunkte detektiert. In Bezug auf Veränderungen in der Knochenzellzahl zeigte sich in acht Wochen alten weiblichen Mäusen eine Erhöhung der Osteoklasten und Osteozyten wohingegen diese Effekte in männlichen Mäusen nicht sichtbar waren. Jedoch war in acht Wochen alten männlichen Shank2/3 Runx2Cre-Mäusen der Knochenresorptionsmarker carboxyterminale Telopeptide des Typ-1-Kollagnes reduziert. Ein Erklärung der hier gezeigten Ausprägung in Shank2/3 Runx2Cre-Mäusen könnte eine mögliche Beeinflussung der Shank-Genexpression durch Geschlechtshormone sein. Ein Zusammenhang zwischen Geschlechtshormonen und der Shank-Genexpression wurde bisher nur in Neuronen gezeigt. Für die Osteoblasten ist dies noch nicht untersucht. Unklar ist zudem, welche SHANK-Isoformen eine tragende Rolle im Knochenstoffwechsel spielen. Hierfür muss in Zukunft eine Massenspektrometrie-Analyse oder eine Ribonukleinsäure (RNA)-Sequenzierung zur Detektion der SHANK-Isoformen in Osteoblasten Aufklärung liefern. Weitere Untersuchungen zu molekularen Mechanismen von SHANK im Knochenstoffwechsel sollten an diese Ergebnisse anknüpfen.