Charakterisierung des Pyruvatdehydrogenase-Komplexes aus Corynebacterium glutamicum und Einfluss von Enzymen des anaplerotischen Knotenpunkts auf die Bildung von Valin und Pantothenat

Abstract

Der PEP-Pyruvat-Oxalacetat-Knotenpunkt in C. glutamicum spielt eine essentielle Rolle bei der Bereitstellung von Vorläuferprodukten für die Produktion von Aminosäuren und Vitaminen. Ein Enzym dieses Knotenpunkts, der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC), sollte auf enzymatischer und transkriptioneller Ebene beschrieben werden. Der PDHC zeigte nach Wachstum auf Komplexmedium in der exponentiellen Wachstumsphase mit 106 mU/mg Protein die höchsten spezifischen Aktivitäten. Die E2-Untereinheit (Dihydrolipoamid-Transacetylase) des PDHC von C. glutamicum wird vom aceF-Gen kodiert. Sowohl für diese als auch für die E1-Untereinheit (Pyruvat-Decarboxylase), die vom aceE-Gen kodiert wird, wurden Enzymtests etabliert. Die höchsten PDC-Aktivitäten wurden auf Komplexmedium und Komplexmedium mit Glukose detektiert, wohingegen auf Minimalmedium mit Glukose die spezifische Aktivität um etwa 50 % reduziert war und auf Minimalmedium mit Acetat bzw. Mischsubstrat keine Aktivitäten messbar waren. Die für die DHL-ermittelte spezifische Aktivität lag bei 233 mU/mg Protein auf Komplexmedium, auf allen anderen Kohlenstoffquellen war diese mit 33 bis 50 mU/mg Protein stark verringert. Für die Gene aceE und aceF wurde eine monocistronische Transkription nachgewiesen.

Die Untersuchung rekombinanter Stämme mit veränderten Enzym-Aktivitäten des anaplerotischen Knotenpunktes zeigte deutliche Effekte im Stamm Val1. Die Überexpression des pyk-Gens und die Deletion des pyc-Gens führten zu einem Anstieg der Valinkonzentration, während die Überexpression des pqo-Gens zu einer Verringerung der Valinkonzentration führte. Für den Stamm Val2 war der Effekt bei Überexpression des pyk-Gens nicht nachweisbar und bei Überexpression des pqo-Gens deutlich geringer. Eine Steigerung der Valinproduktion konnte für den Stamm Val2 nach Deletion des aceE-Gens gezeigt werden. Durch Überexpression der Gene ppc, pck und pqo im Stamm Val1 konnten Pantothenatkonzentrationen im Bereich von 10 bis 16 mg/l gemessen werden.