Einluss von Hypothermie auf den Differenzierungsgrad von Chondrozyten : in vitro Untersuchungen in Monolayer und 3D-Kultur

Abstract

Beim Tissue Engineering mit primären humanen Chondrozyten ist die Dedifferenzierung während Zellproliferationsphase in vitro ein limitierender Prozess um eine ausreichende Zellzahl zu generieren für die Besiedelung eines klinisch relevanten Produkts. Obwohl Chondrozyten partiell redifferenzieren sobald sie in eine dreidimensionale (3D) Kultur überführt werden, entspricht eine neu gebildete Knorpelmatrix nicht der Qualität eines Nativknorpels. Es wurde der Einfluss von Hypothermie Bedingungen auf die Dedifferenzierung von humanen Septumchondrozyten untersucht in einer Monolayer Zellkultur zur Proliferation, sowie in einer 3D Pelletkultur. Jede Zellkultur wurde während Zellproliferation entweder bei 32,2 °C oder bei 37 °C kultiviert. Weiter wurden Zellen, die bei diesen Temperaturen proliferiert wurden, in einer Pelletkultur bei 32,2 °C und bei 37° C untersucht. Hinweißgebend auf den zellulären Differenzierungsgrad war die Bestimmung der mRNA knorpelspezifischer Zielgene mittels Polymerase Kettenreacktion (PCR) und hieraus gebildete Quotienten (Kollagen II/Kollagen I; Aggrecan/Versican). Ein jeweils höherer Quotient zeigte einen höheren Differenzierungsgrad an. Histologische und Immunhistochemische Färbungen dienten zur Objektivierung vorhandener Proteine in Pelletkultur. In Monolayer wurde die Zellproliferation mittels 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) kolorimetrisch bestimmt. In Monolayer zeigte sich unter dem Einfluss von 32,2 °C eine signifikant langsamere Zellproliferation verglichen zur Kultur bei 37 °C, ein Dedifferenzierungsprozess verlief bei 32,2 °C ebenso langsamer. In Pelletkultur konnte ein Redifferenzierungsprozess bei beiden Temperaturen nachgewiesen werden, dieser zeigte sich in den Kulturen bei 37 °C ausgeprägter. Mögliche Vorteile durch langsamere Dedifferenzierung in Monolayer unter 32, 2 °C werden durch effektivere Redifferenzierungsprozesse bei 37 °C aufgehoben. Es konnte gezeigt werden dass eine gezielte Verlangsamung der Zellproliferation und Dedifferenzierung bei 32,2 °C in Monolayer zur Zellproliferation keinen Nachteil hat wenn diese Zellen anschließend in eine Pelletkultur bei 37 °C überführt werden.