The effect of rhamnolipid production on Pseudomonas aeruginosa physiology

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is a notorious human pathogen associated with a range of lifethreatening nosocomial infections. P. aeruginosa is known to produce a range of virulence factors that enhance its ability to damage the host tissue and cause disease. One of the most important virulent-related molecules is rhamnolipid. The rhamnolipids are known in P. aeruginosa as a multifunctional surfactant. Identifying the functions of rhamnolipids in detail is clearly warranted to elucidate of the mechanisms of P. aeruginosa pathogenesis and to explore new strategies for treatment. P. aeruginosa regulates rhamnolipid production by using an intercellular communication mechanism called quorum sensing, which is mediated by small signaling molecules, or auto-inducers. In the present study, two rhamnolipid mutants were constructed and their physiological functions on P. aeruginosa were investigated under Pi depletion conditions. In this study, the surface-associated GroEL protein, which can be a host-pathogen interaction and anti-biofilm target, promoted early biofilm formation in P. aeruginosa. Pi depletion is known to rapidly develop following major surgery and organ injury and independently predicts the development of lethal sepsis (261),(106). The QSSM profile identification study for rhamnolipid-deficient mutants revealed high PQS and C4-HSL levels that significantly impact several virulence-associated phenotypes, such as Pvds-regulated endoprotease, lipase and phospholipase production, which was confirmed by extracellular proteomic and phenotypic analyses. However, similar phenotypic characteristics for a mono-rhamnolipid-producing strain and wild type PAO1 were obtained. The non-swarming and flat biofilm forming phenotype of the ∆rhlA strain suggested an altered outer membrane protein profile, which was verified by proteomic analyses. Furthermore, the GroEL protein was detected at different expression levels in a rhamnolipid-deficient mutant compared to wild type PAO1. This result led to the question of whether GroEL has an additional function, and GroEL was successfully overexpressed in a rhamnolipid-deficient mutant for subsequent functional characterization. The higher expression level of extracellular surface-associated GroEL protein was confirmed by extracellular and cytoplasmic proteome analyses. The suggested role was shown by crystal violet assay and the control of cell lysis was confirmed by β-lactamase activity assay and LipH Western blotting analyses. The presented data in this study is the first report of a proteome-based study of rhamnolipid mutants and the surface-associated GroEL and its new role in P. aeruginosa. Moreover, these results indicate anti-biofilm targets in P. aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa ist ein berüchtigter menschlicher Krankheitserreger im Zusammenhang mit lebensbedrohlichen nosocomial-Infektionen. P. aeruginosa ist bekannt, eine Reihe von Virulenzfaktoren zu produzieren, die seine Fähigkeit verbessern, das Wirtsgewebe zu beschädigen und Krankheit zu verursachen. Eine der wichtigsten Virulenzbezogenen Moleküle sind Rhamnolipide. Die Rhamnolipide in P. aeruginosa sind bekannt dafür, multifunktionale oberflächenaktive Stoffe zu sein. Die Identifizierung der Funktionen von Rhamnolipiden im Detail, ist von vorrangiger Wichtigikeit, um die Pathogenese von P. aeruginosa zu verstehen und neue Strategien für die Behandlung zu finden. P. aeruginosa reguliert die Produktion von Rhamnolipiden mittels eines Kommunikationsmechanismus, auch Quorum Sensing genannt, bei dem kleine Signalmoleküle oder Autoinduktoren Informationen zwischen den Zellen vermitteln. In der vorliegenden Studie wurden zwei Rhamnolipid-Mutanten kreiert und ihre physiologische Wirkung auf P. aeruginosa wurde unter Phosphat (Pi)-Mangel untersucht. In dieser Studie förderte das an der Zelloberfläche vorkommende Eiweiß GroEL, das ein Ziel für eine Wirt-Krankheitserreger-Interaktion und ein Ziel für Biofilminhibitoren sein kann, eine frühe Ausformung an Biofilm in P. aeruginosa. Es ist bekannt, dass Pi-Mangel sich rasch nach größeren Operations- und Organverletzung entwickelt, und dass er die Entwicklung tödlicher Sepsis unabhängig vorhersagen kann (261), (106). Die QSSM Profilidentifikationsstudie für Mutanten, die keine Rhamnolipide mehr herstellen, offenbarte hohe Werte an PQS und C4-HSL, die mehrere virulenzzugehörige Phänotypen wie Pvds-regulierte Endoprotease-, Lipase- und Phospholipaseproduktion beeinflussen. Dies wurde mittels Analyse des extrazellulären Proteoms und des Phänotyps bestätigt. Es wurden jedoch ähnliche phänotypische Merkmale zwischen einem Stamm, der nur ein Mono-Rhamnolipid produziert, und dem Wild Typ PAO1 festgestellt. Der Phänotyp des ∆rhlA-Stammes, der nicht schwärmt und einen flachen Biofilm formt, weist auf ein geändertes Profil der Eiweißzusammensetzung hin; dies wurde mittels Analyse des Proteoms überprüft. Desweiteren zeigte das GroEL-Eiweiß ein anderes Expressionsniveau in einer Rhamnolipid-Mutante verglichen mit dem Wildtyp PAO1. Dieses Ergebnis führte zur Frage, ob GroEL eine zusätzliche Funktion hat und GroEL wurde erfolgreich in der Rhamnolipid-Mutante überexpremiert für eine anschließende funktionelle Charakterisierung. Das höhere Expressionsniveau des extrazellulären oberflächenzugehörigen GroEL-Eiweißes wurde mittels extrazellulären und zytoplasmatischen Proteom-Analysen bestätigt. Die vorgeschlagene Rolle für GroEL wurde mittels eines Krystallviolettetest bestätigt, wobei die Zellyse mittels einer β-Lactamase Aktivitätsprüfung und eines Western Blots gegen LipH kontrolliert wurde. Die in dieser Studie gezeigten Daten sind der erste Bericht über eine Proteom-basierte Studie über Rhamnolipid-Mutanten und das oberflächenzugehörige GroEL und seine neue Rolle in P. aeruginosa. Außerdem weisen diese Ergebnisse auf Ziele für Biofilminhibitoren in P. aeruginosa hin.