Evaluierung der diagnostischen Rolle von microRNAs und Validierung ihrer Targets in hepatozellulärem Karzinom

Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die häufigste Form von primärem Leberkrebs (85-90%). Die Standardmethoden zur Diagnose von HCC sind bildgebende Verfahren und Serum-Biomarker, wie Alpha-Fetoprotein (AFP), Des-gamma-Carboxy-Prothrombin (DCP/PIVKA-II) und lektinreaktives Alpha-Fetoprotein (AFP-L3). Diesen Biomarkern mangelt es jedoch an der Sensitivität und Spezifität, die für die Früherkennung von HCC notwendig sind, was wiederum für eine erfolgreiche Resektion oder Behandlung entscheidend ist. Daher besteht ein hoher Bedarf an neuen Biomarkern für die Frühdiagnose von HCC. Mehrere Studien haben gezeigt, dass das Expressionsniveau von microRNAs (miRNA), einer kleinen, nicht codierenden RNA-Spezies, die ins Blut freigesetzt wird, als früher Marker für verschiedene Krankheiten, einschließlich HCC, dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, die diagnostische Rolle von miRNAs bei HCC zu evaluieren, als Einzelmarker, in einer miRNA-Signatur oder in Kombination mit bekannten Protein-Biomarkern. Es wurden 660 Probanden (354 chronisch Lebererkrankte und 306 HCC-Betroffene) rekrutiert. Ein Teil der Proben durchlief ein initiales Screenings mit zwei unabhängigen Methoden, der real-time quantitative PCR (RT-qPCR, n=60) und dem Next-Generation-Sequencing (NGS, n=100), um eine große Anzahl von miRNAs zu bewerten. Dann wurden die Ergebnisse aus den NGS- und RT-qPCR-Screeningansätzen für die Auswahl von 26 miRNAs (einschließlich zweier mutmaßlich neuer miRNAs) kombiniert. Schließlich wurden diese miRNAs auf ihr diagnostisches Potential als Einzelmarker, oder in Kombination mit anderen miRNAs oder den etablierten Protein-Biomarkern AFP und PIVKA-II über RT-qPCR in einer Trainings- (n=200) und Validierungskohorte (n=300) analysiert. MiR-21 und miR-423 konnten in beiden Kohorten als potentielle HCC-Biomarker bestätigt werden, zwei weitere miRNAs (miR-320d und miR-652) zeigten in der Trainingskohorte diagnostisches Potential. Die Kombination von miRNAs als Signatur und mit Protein-Biomarkern verbesserte die klinische Leistung der einzelnen Protein-Biomarker jedoch nicht. Anschließen wurden in silico die Targets der vier potentiellen miRNA-Biomarker, die bei der Apoptose involviert sind, vorhergesagt und für miR-21 auch in vitro validiert. Dabei konnte Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 10d (TNFRSF10D) als mögliches neues Target für miR-21 ermittelt werden.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common type of primary liver cancer (85-90%). The standard methods for diagnosis of HCC are imaging and serum biomarkers, like alpha-fetoprotein (AFP), des-gamma-carboxy prothrombin (DCP/PIVKA-II) and lectin-reactive alpha-fetoprotein (AFP-L3). These biomarkers, however, are lacking the sensitivity and specificity necessary for early detection of HCC, which is crucial for successful resection or treatment. Thus, 2 there is a high need for new biomarkers for the early diagnosis of HCC. Several studies have revealed that an expression level of microRNAs (miRNA), a small, non-coding RNA species released into the blood, can serve as an early marker for various diseases, including HCC. The goal of this study was to evaluate the diagnostic role of miRNAs in HCC, as single markers, in a miRNA signature or in combination with known protein biomarkers. We recruited 660 subjects (354 chronic liver disease- and 306 HCC-affected individuals) and employed a strategy of initial screening by two independent methods, real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR, n=60) and Next-Generation-Sequencing (NGS, n=100) to assess a large number of miRNAs. Then, the results from the NGS and qPCR screening approaches were combined for the selection of 26 miRNAs (including two putative novel miRNAs). Finally, those miRNAs were analyzed for their diagnostic potential as single markers, or in combination with other miRNAs or established protein biomarkers AFP and PIVKA-II via RT-qPCR in a training (n=200) and validation cohort (n=300). MiR-21 and miR-423 could be confirmed as potential HCC biomarkers in both cohorts, two more miRNAs (miR-320d and miR-652) showed a diagnostic potential in the training cohort. The combination of miRNAs as a signature or with protein biomarkers did not improve the clinical performance of the single protein biomarkers. Following, the targets of the four potential miRNA biomarkers that are involved in apoptosis were predicted in silico and validated in vitro for miR-21. Thereby, Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 10d (TNFRSF10D) could be detected as possible new target for miR-21.