Wirkung der Hsp70-spezifischen Inhibitoren HA9 und VER155008 auf die Vergiftung von HeLa-Zellen durch das Diphtherie-Toxin

Abstract

Das von Corynebacterium diphtheriae sezernierte Diphtherie-Toxin (DT) zählt zu den monomer synthetisierten, bakteriellen AB-Toxinen. Die Diphtherie ist trotz weltweiter Impfprogramme auch heute noch endemisch. DT entfacht seine toxische Wirkung auf menschliche Zellen durch die katalytisch aktive A-Domäne, welche den Elongationsfaktor-2 (EF-2) Adenosindiphosphat- (ADP)-ribosyliert und dadurch zum Arrest der Proteinbiosynthese und letztlich zum Zelltod führt. Nach Rezeptor-vermittelter Toxin-Bindung an die Wirtszelle und der konsekutiven Endozytose transloziert die katalytisch aktive Toxindomäne (DTA) aus dem Endosom pH-abhängig ins Zytosol der Wirtszelle. Dabei vermittelt die auf der Rezeptorbindungs-Domäne lokalisierte Transmembran-Domäne die Bildung einer Pore in der Vesikelmembran. Für binäre AB-Toxine wurden bislang mehrere Wirtszell-eigene Faktoren identifiziert, die die zytosolische Aufnahme der enzymatisch aktiven Toxin-Domänen begünstigen. Hierzu zählen die Hitzeschockproteine Hsp90 und Hsp70 sowie Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen wie Cyclophiline und FK506-Bindeproteine. Diese Faktoren sind den Proteinfaltungshelfern zuzuordnen und können für diverse zelluläre Funktionen - die Proteinhomöostase betreffend - in Komplexen kollaborieren. Genannte Chaperone wurden unter Verwendung spezifischer pharmakologischer Hemmstoffe identifiziert, dabei wurde als Wirkort der Inhibitoren – und somit auch der entsprechenden Chaperone - der pH-abhängige Translokationsschritt der katalytisch aktiven Toxin-Domänen identifiziert. Alle Toxine, für die eine Beteiligung genannter Proteinfaltungshelfer nachgewiesen wurde, sind ADP-Ribosyltransferasen. So wurde in vorausgehenden Arbeiten suggeriert, dass es sich bei deren zellulärer Aufnahme um einen gemeinsamen Mechanismus in Abhängigkeit von der enzymatischen Toxinwirkung handelt. Dabei ist es hochwahrscheinlich, dass die genannten Faktoren im Sinne eines Multichaperon-Komplexes interagieren. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig für Hsp70 eine Beteiligung an der zellulären Aufnahme des monomeren DT nachgewiesen. Pharmakologische Inhibition der Chaperon-Aktivität des Hsp70 schützte HeLa-Zellen zeitlich begrenzt vor Vergiftung durch das DT. Die beiden spezifischen Inhibitoren HA9 und VER155008 (VER) setzen an zwei unterschiedlichen enzymatischen Zielstrukturen des Hsp70 an und hemmen die Vergiftung von HeLa in vergleichbarem Ausmaß. Dabei ist der exakte Mechanismus der Interaktion des Hsp70 mit DTA oder dessen Rolle in einem Multichaperon-Komplex noch ungeklärt. Mittels etablierter Experimente wurde der zytosolische Translokationsprozess des DTA über vesikuläre Membranen als Ort der Chaperonhemmung /Chaperonbeteiligung identifiziert und andere potentiell Vergiftungs-hemmende Angriffspunkte, wie die Bindung des DT an Oberflächenrezeptoren, oder die Beeinflussung der enzymatischen Toxin-Aktivität ausgeschlossen. Diese Ergebnisse stellen neue Erkenntnisse für den molekularen Aufnahmemechanismus des DT in menschliche Zellen dar und bekräftigen die Hypothese der Beteiligung eines gemeinsamen, spezifischen und einzigartigen Chaperon-Komplexes für die Membrantranslokation bakterieller ADP-Ribosyltranferasen. Weitere Forschung im Hinblick auf die Interaktion der bislang identifizierten Chaperone beim zytosolischen Aufnahmeprozess des DT sind von Nöten. HA9 und VER könnten somit als Basis für die Entwicklung einer ergänzenden pharmakologischen Strategie bei der Behandlung der Diphtherie betrachtet werden. Bislang besteht das Therapieregime aus der frühzeitigen Antitoxin-Gabe und antibiotischer Abdeckung. Hsp70-Inhibitoren hingegen könnten eine ADP-Ribosylierung des EF-2 auch noch nach bereits erfolgter Endozytose der enzymatischen Toxindomäne unterbinden.