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AuthorGerstenberg, Melaniedc.contributor.author
Date of accession2021-01-28T10:58:04Zdc.date.accessioned
Available in OPARU since2021-01-28T10:58:04Zdc.date.available
Year of creation2019dc.date.created
Date of first publication2021-01-28dc.date.issued
AbstractDie Nanotechnologie in medizinischen Anwendungen hat in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen. Grund hierfür ist einerseits die Entwicklung hochauflösender Methoden, welche bei der Analyse und Entwicklung von Krankheiten Anwendung finden, und andererseits die Möglichkeit nanoskopische Systeme zu entwickeln, die spezifisch bestimmte Zell- und Gewebetypen adressieren und somit neue Technologien im Bereich des Wirkstofftransports ermöglichen. Als solches System haben sich mesoporöse Silikananopartikel (MSN) bereits mehrfach ausgezeichnet. Aufgrund ihres großen variablen Porenvolumens ist eine Wirkstoffbeladung mit hohen Beladungsgraden möglich. Zudem kann die Oberfläche der Partikel leicht funktionalisiert werden, um die Eigenschaften der Partikel sowie deren Selektivität einstellen zu können. Aufgrund der hydrolytischen Instabilität der mesoporösen Silikapartikel kann es jedoch zu einer schnellen Ablösung dieser Funktionalitäten kommen, was unter anderem mit einem Verlust der Selektivität einhergeht. Eine weitere Hürde ist die schnelle Ausscheidung der unfunktionalisierten Partikel aus dem Blutkreislauf. Um diese Hindernisse zu überwinden und gleichzeitig die Kontaktfläche für eine zelluläre Wechselwirkung zu erhöhen, sollen die Partikel nicht-kovalent an Peptidnanofibrillen (PNF) angebunden werden, welche die RGD-Sequenz als Selektivitätsmotiv aufweisen und somit an die auf vielen Krebszellen überexpressionierten Integrinrezeptoren binden können. In dieser Arbeit soll die Eignung dieses modularen Wirkstofftransportsystems für den selektiven Transport hydrophiler sowie hydrophober Wirkstoffe in A549-Lungenkrebszellen untersucht werden. Hierfür wurden zunächst die Einzelkomponenten synthetisiert. Der verwendeten Synthese der MSN lag der Sol-Gel-Prozess in Kombination mit dem Endotemplatverfahren zugrunde. Hierdurch konnten Partikel mit einem mesoporösen Porensystem und unterschiedlichen Funktionalisierungen hergestellt werden. Um die spätere Anbindung an die PNF zu optimieren, wurden unfunktionalisierte Partikel als auch amin- und carboxyfunktionalisierte MSN synthetisiert und charakterisiert. Als zweite Komponente dienen die Peptide mit dem Grundgerüst KFKFEFEF in seiner unfunktionalisierten Form als auch mit der Sequenzerweiterung GGR(G/A)DS am C-Terminus, um ein Selektivitätsmotiv in das Fibrillennetzwerk einbringen zu können. Die Synthese wurde mittels Festphasenpeptidsynthese nach Merrifield durchgeführt. Teil dieser Arbeit war zudem die Optimierung dieser Synthese zur Anwendung ohne den Einsatz eines mikrowellenassistierten Synthesizers. Im Anschluss an die erfolgreiche Synthese der Peptide mit und ohne den Einsatz von Mikrowellen, wurden die in wässrigem Medium ausgebildeten PNF mittels Dynamischer Lichtstreuung, Zetapotentialmessungen, transmissionselektronenmikroskopischer Aufnahmen sowie Infrarotspektroskopie in ihrer Bildung und Beschaffenheit untersucht. Hierbei war es möglich durch Mischen der unfunktionalisierten und der RGD-funktionalisierten Peptidstocklösung homogene Mischaggregate mit definiertem RGD-Anteil herzustellen. Über den Anteil des RGD-Peptids wird zudem das Zetapotential der Aggregate sowie deren Größe und Sekundärstruktur beeinflusst. Nach der erfolgreichen Synthese und Charakterisierung der beiden Einzelbausteine, wurde die Anlagerung der unterschiedlich funktionalisierten MSN an die PNF analysiert. Da hierbei lediglich für die carboxylierten MSN neben einer homogenen Verteilung der Partikel über die Aggregate auch eine leichte Fluoreszenzmarkierung möglich war, wurden diese Partikel für die weiteren Experimente ausgewählt. Hierbei wurde mittels eines neuen Ansatzes der Durchflusszytometrie die MSN-Anlagerung an die unterschiedlichen PNF charakterisiert und diese transmissionselektronen- als auch konfokalmikroskopisch visualisiert. Hierbei wurde neben der Optimierung der Inkubationszeit auch eine mögliche Sättigung der PNF mit MSN untersucht. Nach 45 min Inkubation und bei einer MSN-Konzentration von 150 µg/µmol Peptid kam es für alle drei Fibrillen zu einer vollständigen Anlagerung der eingesetzten MSN an die PNF. In einem weiteren Experiment sollte untersucht werden, ob es ebenfalls möglich ist, die Partikel durch Zugabe zu den Fibrillen während ihrer Ausbildung in deren Netzwerk miteinzubauen. Dies konnte mittels transmissionselektronenmikroskopischer Aufnahmen bestätigt werden, wobei es durch die Anwesenheit der MSNs bei Fibrillenausbildung zu einer veränderten Sekundärstruktur dieser kommt. Um als Wirkstofftransportsystem geeignet zu sein, sind die Biokompatibilität sowie das Verhalten des Systems unter biologisch relevanten Bedingungen von großer Bedeutung. Um dies zu untersuchen, wurde der hydrolytische Abbau der Partikel in An- und Abwesenheit der Fibrillen mittels Untersuchungen der Überstände über ICP-OES analysiert, wobei die PNF keinen Einfluss auf den Abbau der Partikel nehmen. Zudem zeigten transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen einen nahezu vollständigen Abbau der Partikel nach 48 h. Dieses Abbauverhalten der Partikel kann durch die Einlagerung der MSN in das Fibrillennetzwerk stark gehemmt werden, da diese hierbei vollkommen von Peptiden ummantelt vorliegen. Im Gegenzug hierzu beeinflussen die eingelagerten MSN den Abbau der ß-Faltblattstrukturen der PNF nicht, während die nachträglich an die Aggregate angelagerten MSN diesen proteolytischen Abbau verlangsamen. Alles in allem konnte gezeigt werden, dass die Komponenten eine gewisse Stabilität unter biologisch relevanten Bedingungen aufweisen, mit der Zeit aber dennoch abgebaut werden. Während die Proteinadsorption über Gelelektrophorese analysiert wurde, wurde die Biokompatibilität mittels Zellviabilitätsassays anhand von A549-Zellen untersucht. Hierbei konnte auch nach 48 h kein nennenswerter Einfluss der Einzelkomponenten als auch der Kombinationen aus PNF und MSN auf die Zellvitalität detektiert werden. In einem letzten Schritt zur Untersuchung der Eignung als Wirkstofftransportsystem sollte die zelluläre Anbindung und somit die Selektivität des Systems genauer analysiert werden. Mittels durchflusszytometrischer Messungen und konfokalmikroskopischer Aufnahmen wurde die Anlagerung der PNF an die A549-Krebszellen untersucht. Hierbei konnte für die unfunktionalisierten PNF keinerlei Anbindung detektiert werden, während die funktionalisierten PNF mit steigendem RGD-Anteil einen Anstieg in ihrer Zellanlagerung detektieren ließen. Um die Selektivität weiter zu untermauern, wurden zusätzlich Messungen nach Sättigung der Zellen mit dem Peptid GGRGDS, welches das RGD-Bindungsmotiv der Integrinrezeptoren blockiert, durchgeführt. Nachdem die selektive Anbindung der RGD-PNF an die Zellen verifiziert worden war, wurden Daunorubicin- als auch DiO-beladene MSN an die PNF angelagert und deren Transporteigenschaften sowie die Freisetzungsmechanismen der Wirkstoffe mittels Konfokalmikroskopie genauer analysiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass auch eine sequenzielle Zugabe der beiden Komponenten eine Möglichkeit des Wirkstofftransportes darstellt. Hierbei wurden zunächst die PNF an die Zellen angelagert, während die MSN-Zugabe erst im Anschluss erfolgte. Hierdurch ergaben sich Änderungen in der freigesetzten DiO-Menge, was weitere Rückschlüsse über den möglichen Aufnahmemechanismus des DiO in das Zellinnere erlaubt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Arbeit erfolgreich ein System entwickelt wurde, welches als neuartiges modulares Wirkstofftransportsystem sowohl hydrophile als auch hydrophobe Wirkstoffe selektiv zu Krebszellen mit überexpressionierten Integrinrezeptoren transportieren kann. Dieses System weist neben einer guten Biokompatibilität auch eine Bioabbaubarkeit auf. Mittels Variation einiger Parameter konnten zudem Einblicke in den Mechanismus des Wirkstofftransportes in die Zellen erlangt werden.dc.description.abstract
Languagededc.language.iso
PublisherUniversität Ulmdc.publisher
LicenseStandarddc.rights
Link to license texthttps://oparu.uni-ulm.de/xmlui/license_v3dc.rights.uri
KeywordMesoporöse Silikananopartikeldc.subject
KeywordPeptidnanofibrillendc.subject
KeywordRGDdc.subject
KeywordGezielter Medikamententransportdc.subject
KeywordProteinadsorptiondc.subject
Dewey Decimal GroupDDC 540 / Chemistry & allied sciencesdc.subject.ddc
Dewey Decimal GroupDDC 610 / Medicine & healthdc.subject.ddc
LCSHMesoporous materialsdc.subject.lcsh
TitleModulares Wirkstofftransportsystem auf Basis von Peptidnanofibrillen und mesoporösen Silikananopartikelndc.title
Resource typeDissertationdc.type
Date of acceptance2020-01-30dcterms.dateAccepted
RefereeLindén, Mikadc.contributor.referee
RefereeWeil, Tanjadc.contributor.referee
DOIhttp://dx.doi.org/10.18725/OPARU-34627dc.identifier.doi
PPN1745990569dc.identifier.ppn
URNhttp://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:289-oparu-34689-1dc.identifier.urn
GNDNanostrukturiertes Materialdc.subject.gnd
GNDRGD-Sequenzdc.subject.gnd
FacultyFakultät für Naturwissenschaftenuulm.affiliationGeneral
InstitutionInstitut für Anorganische Chemie II (Synthese und Charakterisierung anorganischer Materialien)uulm.affiliationSpecific
InstitutionKompetenzzentrum "Ulm Peptide Pharmaceuticals (U-PEP)"uulm.affiliationSpecific
Grantor of degreeFakultät für Naturwissenschaftenuulm.thesisGrantor
DCMI TypeTextuulm.typeDCMI
CategoryPublikationenuulm.category
University Bibliographyjauulm.unibibliographie


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