Aktivierung der Telomerase in der Hepatokarzinogenese und im duktalen Pankreaskarzinom

Abstract

In Deutschland gehören Krebserkrankungen mit zu den häufigsten Todesursachen überhaupt. Dabei spielen gastroenterologische Krebserkrankungen wie das hepatozelluläre Karzinom (HCC), das cholangiozelluläre Karzinom (CCA) oder auch das Pankreaskarzinom durch ihre schlechte Prognose eine nicht zu vernachlässigende Rolle. Bei näherer Betrachtung der Karzinogenese solider Tumoren stehen unter anderem die Inaktivierung des Tumorsuppressors p53 und die Aktivierung der Telomerase im Fokus der Aufmerksamkeit. Diese Arbeit konzentrierte sich im Speziellen auf aktivierende TERT Promotor Mutationen, die in einigen Tumorentitäten, wie beispielsweise dem HCC, eine Rolle spielen. Diese Mutationen führen zu einer verstärkten Aktivität der Telomerase und somit zu einer Aufrechterhaltung der Telomerlänge und Vermeidung von Zellzyklusarrest, sodass sich die betroffenen Zellen dann ungehindert weiter teilen können. Hierfür wurde mit hepatozellulären, cholangiozellulären und pankreatischen Karzinomzelllinien gearbeitet. Zunächst sollten durch die DNA-Sequenzierung des TERT Promotors Mutationen im Bereich des Promotors der Telomerase untersucht werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass die hepatozelluläre Karzinomzelllinie im Gegensatz zu den pankreatischen Karzinomzelllinien über eine heterozygote Mutation im Bereich des TERT Promotors verfügte. Die nachfolgende Überprüfung der Telomeraseaktivität der verschiedenen Krebszelllinien mithilfe eines TRAP-Assays (telomeric repeat amplification assay) konnte zeigen, dass bei allen untersuchten Krebszelllinien, unabhängig vom Auftreten einer TERT Promotor Mutation, aktive Telomerase beobachtet werden kann. Dies unterstützt die Hypothese, dass neben aktivierenden Mutationen im TERT Promotor auch noch weitere die Telomerase aktivierende Mechanismen eine Rolle spielen. Um die Mechanismen am TERT Promotor in der Hepatokarzinogenese zu untersuchen, wurden verschiedene Karzinomzelllinien mit sich in ihrer Länge unterscheidenden TERT Promotor Konstrukten transfiziert. Dies ermöglichte eine Analyse und somit einen Vergleich der unterschiedlichen Regionen des Promotors mithilfe eines dualen Luciferase-Assays. Die Ergebnisse dieses Versuches lenkten die Aufmerksamkeit auf das Activator-protein 1 (AP-1), da es in der Lage ist, die Aktivität des Promotors durch direkte Bindung zu verändern. So wurden in einem Experiment die RNA-Expression von AP-1 sowohl im murinen Leber- und Tumorgewebe als auch in humanen Krebszelllinien untersucht, um Unterschiede hinsichtlich der Hepatokarzinogenese bei der Maus und beim Menschen fokussieren zu können. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Expression in den humanen Krebszelllinien herunterreguliert war, während in den murinen Tumorgeweben eine Hochregulation der Genexpression beobachtet werden konnte. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Untersuchung der murinen Hepatokarzinogenese. Hierfür wurde die Auswirkung einer leberspezifischen p53-Deletion auf die CCl4-induzierte Hepatokarzinogenese der Maus untersucht. Dabei wurden sowohl Wildtyp-Mäuse als auch Mäuse mit leberspezifischer p53-Deletion mit der lebertoxisch wirkenden Substanz Tetrachlormethan (CCl4) behandelt und im Anschluss getötet und analysiert. Es zeigte sich, dass bei allen Mäusen mit leberspezifischer p53-Deletion Tumore in der Leber detektiert werden konnten. Die Wildtyp-Mäuse dagegen, denen zu denselben Bedingungen CCl4 appliziert wurde, wiesen keine Lebertumore auf. Dies deutet auf eine verstärkte Leberschädigung der CCl4-Behandlung bei gleichzeitig vorliegender Deletion von p53 hin. Auch die Ergebnisse der histologischen Untersuchung und der Analyse des Stromaanteils der Leber- und Tumorgewebe der Mäuse unterstützen diese Vermutung, da das Lebergewebe der Mäuse mit leberspezifischer p53-Deletion mehr pathologische Charakteristika aufwies als das Lebergewebe der Wildtyp-Mäuse. Des Weiteren konnten geschlechtsspezifische Unterschiede bei der Tumorentwicklung beobachtet werden.