Charakterisierung der Interaktion des C2-Toxins von Clostridium botulinum mit Cyclophilin A

Abstract

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der zellulären Aufnahme des C2-Toxins von Clostridium botulinum, insbesondere mit der Frage, wie das zelluläre Faltungshelferenzym Cyclophilin A den Membrantransport der Enzymuntereinheit des Toxins aus Endosomen in das Zytosol vermittelt. Das C2-Toxin ist ein binäres Aktin-ADP-ribosylierendes Toxin und besteht aus zwei Proteinen, der Enzymkomponente C2I und der separaten Bindungs-/Translokationskomponente C2IIa. Nach Rezeptor-vermittelter Endozytose gelangt der C2IIa/C2I-Komplex in frühe saure Endosomen. Dort ändert C2IIa seine Konformation und bildet Poren in Endosomenmembranen, durch die entfaltetes C2I in das Zytosol transloziert. In der Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass dabei das Chaperon Hsp90 und Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) wie Cyclophilin A eine entscheidende Rolle spielen. Zu Beginn der Dissertation stand die Hypothese, dass die N-terminale Domäne von C2I mit Cyclophilin A interagiert, da hier ein Prolinrest an Position 195 in einem XaaP-Motiv vorliegt, das vermutlich eine Erkennungssequenz für PPIasen darstellt. Daher wurde dieses Prolin durch gerichtete Mutagenese ausgetauscht, um seine Rolle bei der Interaktion mit Cyclophilin zu testen. Die rekombinanten Proteine C2IP195E und C2IP195G wurden in Escherichia coli exprimiert und im Vergleich zu wildtypischem C2I (WT-C2I) biochemisch charakterisiert. Ein Proteaseverdau ergab, dass C2IP195E nicht korrekt gefaltet und dadurch enzymatisch inaktiv war. C2IP195G zeigte vergleichbare Eigenschaften wie WT-C2I. Die C2IIa-vermittelte Aufnahme von C2IP195G wurde durch Cyclosporin A, dem Inhibitor von Cyclophilin A, nicht gehemmt, was zeigt, dass Prolin-195 nicht entscheidend für die Interaktion von C2I mit Cyclophilin ist. Die Ergebnisse zeigen, dass C2I mit Cyclophilin A unabhängig von einem XaaP-Motiv interagiert und liefern somit einen neuen Beitrag für das Verständnis der Interaktion zwischen PPIasen und Bakterientoxinen in Säugetierzellen.