Charakterisierung der NAHR-Hotspots PRS1 und PRS2, die NF1-Mikrodeletionen vermitteln

Abstract

Meine Untersuchungen umfassten 78 Patienten mit Typ 1 NF1 Deletionen, welche eine Größe von 1,4 Mb haben und in der Keimbahn eines gesunden Elters entstanden sind (Keimbahn-Deletionen). Typ 1 NF1 Deletionen sind selten und treten mit einer geschätzten Frequenz von 1:60.000 auf. Ursache dieser Deletionen ist eine nicht allelische homologe Rekombination (NAHR) zwischen den beiden paralogen Low-Copy-Repeats NF1-REPa und NF1-REPc. NAHR ist der Mutagenese-Mechanismus, der für die Entstehung von rekurrenten krankheitsassoziierten Deletionen oder Duplikationen im menschlichen Genom verantwortlich ist. Das Ziel meiner Arbeit war eine genaue Kartierung der Deletionsbruchpunkte innerhalb zweier Hotspots für NAHR, den paralogen Rekombinationsstellen 1 und 2 (PRS1 und PRS2). Anhand dieser Kartierung sollten Eigenschaften der betroffenen Bruchpunktbereiche (Strangaustauschregionen, SERs) untersucht werden, die Einfluss auf das Auftreten und die Häufigkeit der vorliegenden NAHR-Ereignisse ausüben könnten. Durch meine Analyse konnte ich die Bruchpunkte der NF1 Deletionen auf SERs von 149 bp bis 1,1 kb eingrenzen. Ein Großteil der Bruchpunkte akkumulierte in Kernbereichen innerhalb der Hotspots. Der Kernbereich in PRS1 von 1 kb enthielt 71 % der in diesem Hotspot lokalisierten Bruchpunkte und der Kernbereich in PRS2 von circa 2 kb enthielt 80 % der Bruchpunkte der PRS2-vermittelten Deletionen. Unter den 78 NF1 Deletionen wiesen 60 (76,5 %) den Bruchpunkt in PRS2 auf, während 18 Deletionen (19,1 %) SERs in PRS1 hatten. Somit ist PRS2 im Vergleich zu PRS1 ein deutlich aktiverer Hotspot mit einer höheren NAHR-Häufigkeit. Bei der genaueren Analyse der beiden Hotspots konnte ich feststellen, dass sich PRS1 und PRS2 hinsichtlich der Anzahl an möglichen Bindungsstellen für das in die Rekombination involvierte Protein PRDM9 unterscheiden. Während in PRS2 vier solcher Bindungsstellen auftreten, liegt in PRS1 nur eine Bindungsstelle, die zudem außerhalb des Kernbereiches lokalisiert ist. Die höhere Anzahl an PRDM9-Bindungsstellen in PRS2 im Vergleich zu PRS1 könnte mit der erhöhten NAHR-Aktivität in PRS2 zusammenhängen. Hohe Sequenzhomologie ist eine Vorrausetzung für NAHR und ausgedehntere Bereiche von Sequenzidentität zwischen paralogen Sequenzen könnten zu einer erhöhten NAHR Rate führen. Hierfür spricht meine Beobachtung, dass nur in PRS2, nicht aber in PRS1 oder flankierenden paralogen Bereichen, eine 700 bp Region perfekter Sequenzhomologie zwischen den beiden NF1-REPs auftritt. Diese Region könnte zu der erhöhten NAHR-Aktivität in PRS2 beitragen. Beide NAHR Hotspots, PRS1 und PRS2, unterscheiden sich von den jeweils flankierenden Sequenzen innerhalb der homologen Bereiche von NF1-REPa und NF1-REPc durch eine offene Chromatinstruktur, die der aktiver Promotoren entspricht. Auch das Muster an Histonmodifikationen ist in diesen Hotspot-Bereichen verändert, im Vergleich zu den flankierenden Regionen, was ebenfalls die NAHR Aktivität in PRS1 und PRS2 begünstigen könnte. Um die SERs bei den Patienten mit NF1 Deletionen genau zu bestimmen, habe ich auch die parentalen Haplotypen der PRS1- und PRS2-Regionen sequenziert. Es fiel auf, dass ein überwiegender Teil der PRS2-Haplotypen beider NF1-REPs nicht vollständig mit der jeweiligen Referenzsequenz übereinstimmte. Es zeigte sich eine Sequenzdiversität, die jedoch bei den verschiedenen Haplotypen unterschiedlich hoch war. Auch zwischen den beiden NF1 REPs waren Unterschiede hinsichtlich der Diversität auffällig. So zeigte sich im Fall von NF1 REPa im Gegensatz zu NF1 REPc eine Gruppe von Haplotypen mit einer geringeren Diversität, also nur wenigen Unterschieden zur Referenzsequenz. Diese PRS2 Haplotypen aus NF1-REPa mit niedriger Diversität waren mit einem Anteil von 58 % relativ häufig, wohingegen solche mit hoher Sequenzdiversität vergleichsweise seltener waren (26 %). Interessanterweise waren Unterschiede bei den Haplotypen verschiedener Sequenzdiversität hinsichtlich der Anzahl der möglichen PRDM9-Bindungsstellen festzustellen. Diese Unterschiede könnten die Häufigkeit der Rekombination beeinflussen. Jedoch konnte ich keinen Einfluss der Höhe der Sequenzdiversität auf die Häufigkeit der NAHR mit Crossover in PRS2 feststellen. Meine Analysen sprechen jedoch dafür, dass die Rate der nicht allelischen homologen Rekombination ohne Crossover (NAHGC) von der unterschiedlichen Sequenzdiversität beeinflusst wird. Die Teilung der PRS2 Haplotypen aus NF1 REPa in zwei Gruppen mit entweder hoher oder niedriger Sequenzdiversität wurde bei den Eltern der Patienten europäischer Abstammung beobachtet. Bei Individuen afrikanischer Abstammung konnte dagegen kein erhöhter Anteil an NF1 REPa Haplotypen mit niedriger Diversität festgestellt werden. Meine Analysen zeigen also deutliche populationsspezifische Unterschiede der Sequenzdiversität im Bereich des PRS2 Hotspots in NF1-REPa. Die hohe Sequenzdiversität mancher PRS2-Haplotypen aus NF1-REPa, die insbesondere bei Afrikanern häufig auftritt, ist demnach anzestral und sehr wahrscheinlich durch NAHGC zwischen den NF1-REPs entstanden, wofür auch der hohen Anteil an shared SNPs (single nucleotide polymorphisms) zwischen NF1-REPa und NF1-REPc spricht. Trotz der hohen Anzahl an shared SNPs ist die Menge an paralogen Sequenzvarianten (PSVs) im Bereich der NAHR Hotspots PRS1 und PRS2 ausreichend, um die Typ 1 Deletionsbruchpunkte genau zu kartieren, was meine Analysen belegen. Damit eignen sich Typ 1 NF1 Deletionen als ein Modellsystem, um die Prozesse zu analysieren, welche die NAHR Hotspots ebenso wie die Häufigkeit der NAHR beeinflussen.