Identifizierung von spezifischen Methylierungsmustern in Zelllinien der akuten myeloischen Leukämie

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden das Gen-Expressionsprofil von verschiedenen akuten myeloischen Zelllinien untersucht und Profile von unbehandelten Zelllinien mit gesundem menschlichen Knochenmark, CD34+-Zellen sowie AML-Linien nach Behandlung mit einem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (5’-Aza-2’-Deoxycytidin) und einem Histondeacetylase-Inhibitor (Trichostatin A) verglichen. Nach RNA-Extraktion, radioaktiver Markierung und Hybridisierung der entsprechenden Proben auf Microarrays erfolgten die qualitativen und quantitativen Analysen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Microarray-Methodik prinzipiell als Untersuchungsmethode ein umfassendes Profil der Gen-Expression erlaubt und bestimmte Gene mit verändertem Expressionsstatus detektiert werden können. Die am häufigsten betroffenen Gene spielen eine zentrale Rolle im Zellzyklus, in der Chromatinanordnung sowie im Metabolismus und in der Transkription der Zelle (MEK2, CHES1, EphA8, PDCD2, SWI/SNF, Prefoldin5, AP3d1, RAB7 und andere). Mittels antikörperspezifischer Western-Blot-Untersuchungen konnte an einigen ausgewählten Genen (MEK2, CHES1, EphA8) gezeigt werden, dass die mittels Microchip-Analyse auf RNA-Ebene angezeigte Expression auch auf Proteinebene übertragbar ist. MEK2 gehört zum Ras/MAPK/ERK-Pathway und wird weder in CD34+-Zellen noch im gesunden Knochenmark exprimiert. MEK2 phosphoryliert und aktiviert ERK, welches Transkriptionsfaktoren, Metabolismus und Chromatinanordnung der Zelle steuert. Der zugrunde liegende Mechanismus der Downregulierung von MEK2 ist noch unklar. Aufgrund der erhobenen Daten ist es jedoch nahe liegend, dass ein Gen upstream von MEK2 im ras-Pathway durch De-Methylierung aktiviert wird und infolgedessen sekundär MEK2 inhibiert. Als weiteres Gen, welches bei mehreren myeloischen Neoplasien durch epigenetische Mechanismen reguliert wird, konnte EphA8 identifiziert werden. EphA8 gehört zur Familie der Ephrin-Rezeptoren, die inhibierend die ras/MAP-Kaskade regulieren. Ein weiteres detektiertes Gen ist CHES1, das in CMK, NB-4 und Kasumi-1 nicht exprimiert wird und durch De-Methylierung re-induzierbar ist. Die re-induzierte Expression des Gens bei Kasumi-1 und HL-60 (beide FAB-Gruppe M2) durch inhibierte Histon-Deacetylierung zeigt hier, dass CHES1 eine Rolle in der epigenetischen Regulation spielt. Nach Prüfung der Array-Ergebnisse durch visuelle Kontrolle der Mikrochips und Bestätigung durch andere Methoden können Daten aus den vorliegenden Untersuchungen eine wichtige klinische Bedeutung haben, indem sie in Screeningverfahren eingesetzt werden können. Die ermittelten Gene mit AML-spezifisch reguliertem Expressionsprofil beziehungsweise die Gene, die nach Behandlung mit DNA-Methyltransferase-Inhibitor und/oder Histon-Deacetylase-Inhibitor re-induzierbar sind, können auf Mikrochips gespottet werden, um so Patienten vorzuselektieren, die von einer Behandlung mit diesen Wirkstoffen profitieren. Außerdem lassen sich Arrays mit Genen generieren, die mit Prognosefaktoren assoziiert sind.