In vitro Studien zum Potenzial von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen Nervenzellen zu ersetzen

Abstract

Fragestellung: Nerve/glial antigen 2 (NG2)-Glia stellen im Zentralen Nervensystem eine mitotisch aktive, endogene Vorläuferpopulation dar. Aus ihr entstehen lebenslang Oligodendrozyten und während der Hirnentwicklung auch Astrozyten. Darüber hinaus werden NG2-Glia als Quelle für eine endogene neuronale Zellersatztherapie diskutiert. In vitro Experimente mit postnatalen NG2- Glia im Ratten- und Mausmodell sollen im Rahmen dieser Arbeit Aufschluss darüber geben, ob und unter welchen Bedingungen NG2-Glia zu Nervenzellen transdifferenzieren können. Die neurogenen, hochkonservierten Basic Helix Loop Helix Transkriptionsfaktoren Paired box 6 (Pax6) und Neurogenin 2 (Ngn2) wurden als geeignete Kandidaten identifiziert um das Zellschicksal von NG2-Glia zu beeinflussen. Material und Methoden: Im Rahmen dieser Arbeit wird eine primäre Zellkultur von NG2-Glia aus der Ratte und aus der Maus etabliert. Zur Aufreinigung der Zellen werden verschiedene Methoden wie eine rein mechanische Separation, Magnet activated cell sorting und Immunopanning angewendet. Die angereicherten NG2-Glia werden in vitro mit Retroviren transduziert, um die Gene für die neurogenen Transkriptionsfaktoren Pax6 oder Ngn2 ektop zu exprimieren. Die transduzierten Zellen werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transduktion mit einem Reporter-kodierenden Kontrollvirus, Pax6-Virus oder Ngn2-Virus mittels Immunzytochemie charakterisiert. Ergebnisse: Die Transduktion mit dem Kontrollvirus hat keinen Einfluss auf das Zellschicksal. Im Vergleich zum Kontrollvirus ist der Anteil der transduzierten neuronalen Zellen in der Rattenkultur 10 Tage und 14 Tage nach Transduktion mit dem Pax6-Virus signifikant erhöht. Nach Transduktion mit dem Ngn2-Virus in der Rattenkultur ist der Anteil von β3Tubulin+-Zellen im Vergleich zum Kontrollvirus bereits nach 4 Tagen signifikant um das 10-fache erhöht. Zugleich ist der Anteil transduzierter O4+-Zellen im Vergleich zum Kontrollvirus signifikant geringer. Diese Ergebnisse lassen sich in der Mauskultur nach Transduktion mit dem Kontrollvirus, Pax6-Virus und Ngn2-Virus replizieren. Diskussion: Da die forcierte Expression von Pax6 nach aktueller Datenlage keine neuronale Transdifferenzierung von Astrozyten induziert, ist der signifikante Anstieg neuronaler Zellen nach Transduktion auf das neurogene Potenzial von NG2-Glia zurückzuführen. Der signifikante Anstieg an transduzierten neuronalen Zellen nach Transduktion mit dem Ngn2-Virus bei gleichzeitig signifikanter Abnahme an transduzierten NG2-Glia stütz die Hypothese einer Transdifferenzierung von NG2-Glia zu Neuronen. Diese Beobachtung ist konsistent mit vorangegangenen in vitro- Studien zur Reprogrammierbarkeit von Astrozyten zu Neuronen nach Transduktion mit dem Ngn2-Virus. Zur abschließenden Beurteilung, in welchem Umfang die Neurogenese nach Transduktion mit dem Ngn2-Virus von NG2-Glia ausgeht, sind Abstammungsstudien z.B. im NG2-GFP-Mausmodell anzuschließen. Der beobachtete neurogene Effekt nach Transduktion mit dem Pax6- und dem Ngn2-Virus ermutigt weitere Reprogrammierungsstudien um NG2-Glia als endogene Stammzellpopulation zum Ziel einer neuronalen Zellersatztherapie zu machen.