Inhibitor-assisted synthesis of core-shell molecularly imprinted microparticles for protease recognition

Abstract

In medical, environmental, chemical and food sciences, there is a growing need for efficient and selective separation and isolation of specific target substances in complex mixtures. A promising method to meet this need is templating polymers for the creation of selective synthetic receptor materials based on cross-linked polymeric networks, so-called molecularly imprinted polymers (MIPs). Nevertheless, the imprinting of biomacromolecules especially proteins is a challenging task in comparison to small molecules due to their large dimensions, limited solubility and stability, complex structure, and structural flexibility in solution. A very promising and innovative technique for the imprinting of biomolecules is inhibitor-assisted imprinting. In this cumulative thesis based on four peer-reviewed journal articles, core-shell MIPs are produced via the inhibitor-assisted surface imprinting technique for the specific binding of proteases from biotechnologically relevant media. In the first part of this thesis, pepstatin-assisted surface-imprinted core-shell microbeads for the aspartic protease pepsin were synthesized serving as selective sorbent material for solid phase extraction (SPE) applications. The non-porous and porous silica microparticles as core material were prepared by co-condensation of tetraethylorthosilicate (TEOS) and (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS) in a water/oil (W/O) emulsion system. Then, pepstatin - a selective inhibitor of pepsin - was immobilized onto the silica microspheres to pre-organize the pepsin with a defined orientation at the surface prior to the imprinting procedure. The functional monomer 3-aminophenylboronic acid (APBA) was used to establish imprinted polymer films at the surface. In SPE studies, MIPs synthesized using porous silica beads have shown approximately eight times higher uptake capacity for pepsin compared to MIPs produced using non-porous silica beads. Furthermore, MIPs based on porous particles have demonstrated exquisite selectivity for pepsin during individual protein rebinding studies, and more importantly, during competitive rebinding studies in protein mixtures. In the second part of the thesis, the concept of inhibitor-assisted surface imprinting was combined with the dummy imprinting technique to develop recognition materials for matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) and matrix metallopeptidase 12 (MMP-12). The neutral metalloprotease thermolysin was selected as a commercially available surrogate for the preparation of synthetic affinity materials for MMP-9 and MMP-12. Phosphoramidon, a membrane metallo-endopeptidase inhibitor, was attached as a position-directing binding motif for thermoylsin onto the surface of the porous silica microparticles. The surface of the porous microparticles was covered with an imprinted polymer film using acrylamide and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine as functional monomers and N,N'-methylenebisacrylamide as crosslinker. The resulting dummy MIPs have shown a high selectivity for the metalloproteases MMP-9 and MMP-12 in Chinese hamster ovary (CHO) cell culture supernatant. In summary, the inhibitor-assisted surface imprinted core-shell beads developed within this dissertation are suitable to address the challenges in the field of protease purification and isolation from biotechnologically relevant media.

In den Medizin-, Umwelt-, Chemie- und Lebensmittelwissenschaften wächst der Bedarf an effizienter und selektiver Filtration und Isolierung spezifischer Zielsubstanzen in komplexen Gemischen stetig. Die Herstellung von selektiven synthetischen Rezeptormaterialien auf Basis vernetzter Polymernetzwerke, so genannte Molekular geprägte Polymere (MIPs), ist eine vielversprechende Methode diese essentielle Aufgabe zu erfüllen. Nichtsdestotrotz ist die Prägung von Biomakromolekülen, insbesondere von Proteinen, aufgrund ihrer Dimensionen, ihrer begrenzten Löslichkeit und Stabilität, ihrer komplexen Struktur und strukturellen Flexibilität in Lösungen eine anspruchsvolle Herausforderung im Vergleich zu kleinen Molekülen. In dieser kumulativen Dissertation, die auf vier bereits veröffentlichten Publikationen in referierten Fachjournalen basiert, wurden core-shell MIPs über die inhibitor-assistierte Oberflächenprägungstechnik für die spezifische Bindung von Proteasen aus biotechnologisch relevanten Medien hergestellt. Im ersten Teil der Arbeit wurden Pepstatin-assistierte oberflächengeprägte core-shell Mikropartikel für die aspartische Protease Pepsin synthetisiert, die als Absorptionsmedium für die selektive Festphasenextraktion von Pepsin dienten. Als Kernmaterial wurden, durch die Kokondensation von Tetraethylorthosilikat (TEOS) und 3-Aminopropyl-trimethoxysilan (APTMS) in einer Wasser-in-Öl-Emulsion (W/O-Emulsion), glatte und poröse Silikapartikel hergestellt. Anschließend wurde Pepstatin - ein selektiver Inhibitor von Pepsin - auf die Oberfläche der Partikel immobilisiert, um das Pepsin mit einer definierten Orientierung an der Oberfläche vor dem Prägevorgang zu organisieren. Das funktionelle Monomer 3-Aminophenylboronsäure (APBA) wurde verwendet, um geprägte Polymerfilme auf die Oberfläche aufzubringen. In SPE-Studien zeigten MIPs, die mit porösen Silikapartikeln hergestellt wurden, eine etwa achtfach höhere Aufnahmekapazität für Pepsin gegenüber MIPs, die mit nichtporösen Silikapartikeln hergestellt wurden. Darüber hinaus konnten die MIPs, die auf poröse Partikel basieren, eine exzellente Selektivität für Pepsin in einzelnen wie auch in kompetitiven Bindungsstudien aufzeigen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Konzept des inhibitor-assistierten Oberflächenprägens mit der Dummy-Prägetechnik kombiniert, um Erkennungsmaterialien für die Matrix-Metallopeptidase 9 (MMP-9) und die Matrix-Metallopeptidase 12 (MMP-12) zu entwickeln. Die neutrale Metalloprotease Thermolysin wurde als kommerziell erhältliches Surrogat für die Herstellung von synthetischen Affinitätsmaterialien für MMP-9 und MMP-12 ausgewählt. Phosphoramidon, ein Membran-Metallo-Endopeptidase-Inhibitor, wurde für die selektive Ausrichtung von Thermolysin auf die Oberfläche der porösen Silika-Mikropartikel aufgebracht. Mithilfe von Acrylamid und 2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin als funktionelle Monomere und N,N'-Methylenbisacrylamid als Vernetzer wurde die Oberfläche der porösen Mikropartikel mit einem molekular geprägten Polymerfilm beschichtet. Im CHO-Zellkulturüberstand bewiesen die erhaltenen Dummy-MIPs eine hohe Selektivität für die Metalloproteasen MMP-9 und MMP-12. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die in dieser Dissertation entwickelten inhibitor-assistierte oberflächengeprägte core-shell Mikropartikel geeignet sind, die Herausforderungen auf dem Gebiet der Proteasereinigung und -isolierung aus biotechnologisch relevanten Medien zu bewältigen.