Einfluss des human paraneoplastic encephalomyelitis antigen D (HuD) auf die Stabilität der mRNA des Tumorsuppressorgens myristoylated alanine-rich C kinase substrate (MARCKS).

Abstract

Die MARCKS-(myristoylated alanine-rich C kinase substrate) Expression wird zellzyklusabhängig auf Ebene der mRNA-Stabilität reguliert. Mit Hilfe eines Tetracyclin-induzierbaren Promotorsystems wurde HuD in der MEF/3T3-Zelllinie stabil exprimiert. Zunächst wurden Plasmide kloniert, die HuD jeweils nach dem induzierbaren Promotor als gesamtes Protein (HuD-ges) oder die ersten beiden RRMs (RNA recognition motif) (HuD-I+II) enthielten. Anschließend wurden diese Plasmide in MEF/3T3-TetOff® Zellen stabil transfiziert. In den HuD-ges bzw. HuD-I+II stabil exprimierenden Zellen konnte in der G0-Phase und nach Wiedereintritt in den Zellzyklus die gleiche MARCKS-mRNA Expression gemessen werden. Sofern die Expression von HuD angeschaltet wurde, konnte in den Zellen keine proliferationsbedingte Degradation der MARCKS-mRNA-Expression festgestellt werden. Wurde die Expression von HuD durch die Zugabe von Doxycyclin zu dem Nährmedium abgeschaltet, konnte eine Herunterregulation der MARCKS-mRNA-Expression nach dem Verlassen der G0-Phase verzeichnet werden. Es konnte gezeigt werden, dass die HuD-Proteine in der Lage sind, die MARCKS-mRNA zu stabilisieren und so vor dem Abbau zu schützen. Dies hatte jedoch keinen nachweisbaren Einfluss auf die MARCKS-Proteinkonzentration in den transfizierten Zellen. Auf die Wachstumsgeschwindigkeit hat HuD kaum einen Einfluss. Aufgrund der signifikant geringeren finalen Zelldichte der HuD-ges exprimierenden Zellen gegenüber den Kontrollen kann ein hemmender Einfluss von HuD-ges auf das Zellwachstum postuliert werden, obwohl keine deutlich erhöhte MARCKS-Expression in den HuD-ges exprimierenden Klonen gemessen werden konnte. Die schlussendliche Zelldichte der HuD-I+II Klone unterschied sich nicht von den Kontrollen. Die Zelllinien, die HuD-ges exprimierten, zeigten eine höhere Zellverdopplungszeit (population doubling time, PDT) als alle anderen Zelllinien. Diese langsamere Wachstumsgeschwindigkeit war jedoch nicht signifikant.