Molekulare Analyse von clivalen und sakralen Chordomzelllinien und Etablierung eines In-vitro-Tumorprogressionsmodells

Abstract

Chordome sind seltene, niedrig-maligne Knochentumoren, von denen ausgegangen wird, dass sie aus zellulären Überresten der Chorda dorsalis entstehen. Die Hauptprädilektionsstellen sind dabei die kranialen und kaudalen Enden der Wirbelsäule. Da sie weitgehend resistent gegenüber konventionellen Chemotherapien sind, ist es von erheblichem Interesse, neue zielgerichtete Therapien für diese Tumorerkrankung zu etablieren. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob klinische und molekulare Unterschiede zwischen Chordomen des Clivus und des Sakrums bestehen. In einer klinischen Analyse des Ulmer Chordomkollektivs konnte gezeigt werden, dass sakrale Chordome größer waren als clivale Chordome und eine höhere Tendenz zu metastasieren und rezidivieren aufwiesen. Zudem wird die Etablierung und Charakterisierung der weltweit dritten clivalen Chordomzelllinie, U-CH14, beschrieben. Mittels Microarray-basierten Expressionsanalysen wurde die Genexpression von den 3 existierenden clivalen Chordomzelllinien mit 9 sakralen Chordomzelllinien verglichen. Hier zeigten sich wesentliche Unterschiede in der Expression von Genen der HOX-Genfamilie, die eine wesentliche Rolle bei der Ausbildung der embryonalen Körperachse und Embryonalentwicklung spielen. Dies konnte mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) und Proteinanalysen auch in situ validiert werden. Sakrale Chordome zeigten hierbei eine signifikant stärkere Expression von Genen des HOXA-Clusters als clivale Chordome. Da diese HOX-Gen-Expression in sakralen Chordomen nicht zu dem typischen rein lokalisationsbedingten Expressionsmuster während der Embryogenese passt, könnte dies auf eine Induktion im Rahmen der Dedifferenzierung in diesen Tumoren hindeuten. Die Expression und auch eine Inhibition dieser Gene wurden bereits in anderen Tumorentitäten beschrieben und könnte somit auch in Chordomen einen potentiellen therapeutischen Ansatz darstellen. Da in sakralen Chordomen häufig ein Verlust des Tumorsuppressorgens CDKN2A beschrieben wurde, wurde der CDKN2A-Status in den clivalen Chordomzelllinien erhoben. Hier konnte in Fluoreszenz-in-situ-Analysen (FISH) ein Verlust dieses Gens nachgewiesen werden. Dieser Verlust führt zu einer konsekutiven Aktivierung des CDK4/6 (cyclin dependent kinase 4/6)-Signalwegs, welcher auf Proteinebene in den clivalen Zelllinien validiert werden konnte. Eine Behandlung der Zelllinien mit dem CDK4/6-Inhibitor Palbociclib führte zu einer Wachstumsinhibition. Palbociclib könnte somit auch für clivale Chordompatienten eine therapeutische Option darstellen. In Kombinationsbehandlungen mit anderen als in Chordomen wirksam beschriebenen Inhibitoren konnte zudem gezeigt werden, dass eine Kombination von Palbociclib mit dem Epidermal growth factor receptor-1 (EGFR-1)-Inhibitor Erlotinib und mit dem Platelet derived growth factor receptor (PDGFR)-Inhibitor Imatinib zu einer stärkeren Wachstumsreduktion führt. Folglich könnte klinisch eine Kombination dieser Substanzen zu einem besseren Therapieansprechen führen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Heterogenität von Chordomen und deren Metastasen. Aus einem sakralen Primarius mit histologisch vielfältiger Morphologie und dessen zwei Metastasen wurde jeweils eine neue, stabile Chordomzelllinie etabliert und diese anhand ihrer Morphologie, Genetik und auf Proteinebene charakterisiert. Mittels Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) wurde zudem ein genetischer Vergleich der DNA der Zelllinien mit DNA des korrespondierenden Tumormaterials durchgeführt. Hier konnte gezeigt werden, dass die genomischen Aberrationen der Zelllinien weitgehend mit denen des Tumormaterials übereinstimmen und dass die Vorläuferzellen der drei neu etablierten Zelllinien U-CH17P, U-CH17S und U-CH17M bereits im Primärtumor gefunden werden konnten. Somit besteht eine klonale Diversität innerhalb des Primärtumors, wobei die verschiedenen Subklone eine unterschiedliche Metastasierungstendenz aufweisen. Die drei Zelllinien U-CH17P, U-CH17S und U-CH17M stellen zudem das erste präklinische Modellsystem dar, um Einblicke in den Metastasierungsprozess in dieser seltenen Tumorerkrankung zu erhalten. So konnten mittels Microarray-Analyse unterschiedlich exprimierte Gene zwischen den Zelllinien aus den Metastasen und aus dem Primarius, detektiert werden. Die Metastasen-Zelllinien U-CH17S und U-CH17M zeigten dabei eine signifikant höhere Expression von Genen, die mit der Migration und Proliferation von Zellen assoziiert sind, wie zum Beispiel CA3, MAGEC2 und DSCR8, als die Zelllinie U-CH17P aus dem Primärtumor. Um zu überprüfen, ob die verschiedenen Subklone ein unterschiedliches Ansprechen auf zielgerichtete Medikamente aufweisen, wurden Inhibitionsversuche und anschließende Zellviabilitätsmessungen an den drei Zelllinien durchgeführt. Hier zeigte sich für jede Zelllinie eine unterschiedliche Sensitivität für die Inhibitoren Palbociclib, Erlotinib und Imatinib. Auch konnte durch eine Kombination von Inhibitoren eine effektivere Zellreduktion erreicht werden.