Transfektion von Tumorzellen mit triplexbildenden Oligodeoxynukleotiden zur Inhibierung der Expression von Bcl-2 und Survivin

Abstract

Triplexbildende Oligonukleotide (TBO) können sequenzspezifisch durch Ausbilden einer Tripelhelix an der DNA die Expression geeigneter Zielgene modifizieren. Es ist hierdurch eine effiziente Gen-Inhibition möglich, die im Vergleich zum Antisense Ansatz aufgrund der geringeren Anzahl der Zielstrukturen in den Zellen deutlich im Vorteil ist. In der vorliegenden Arbeit konnten mehrere potentielle TBO Bindungsstellen im Bcl-2 und Survivin Gen identifiziert und passende Oligonukleotide synthetisiert werden. Im "electrophoretic mobility shift assay" (EMSA) konnten wir eine spezifische Bindung der TBO an die Ziel-DNA aufzeigen. Die spezifische Hemmung der Proteinexpression konnten wir in vitro mit einem speziellen Tet-on Expressionssystem sowie mit einem Luciferase-Reportergen nachweisen. Um die Wirkung der TBO in vivo auf die Expression von bcl-2 und survivin zu untersuchen, wurden diese mit Hilfe von Aufnahme verstärkenden Liposomen transfiziert. Die gegen die Promotorregion und die 3’ untranslatierte Region (3’UTR) gerichteten TBO konnten stabile Triplexe in vitro ausbilden. Im Tet-on Expressionssystem sowie im Luciferase-Reporter System konnten diese TBO die Expression des bcl-2 Proto-onkogens in transient transfizierten HeLa Zellen unterdrücken. Analoge Ergebnisse ließen sich auch am survivin Gen nachweisen. Darüber hinaus zeigten die letztgenannten TBO nicht nur einen in vitro Effekt sondern konnten auch in vivo die Proteinsynthese und Zellproliferation hemmen sowie Apoptose induzieren. Auch mit dem Einsatz transfektionsverbessernder Liposome war es allerdings nicht gelungen, die Bcl-2 Produktion in den Zellen der Lymphomzellinie (DoHH2) effektiv zu blockieren. Insgesamt implizieren die Ergebnisse eine Ausweitung der möglichen TBO Zielsequenzen von der Promotorregion auf die 3’ untranslatierte Region eines beliebigen Zielgens. Es bedarf in Zukunft allerdings noch weiterer Studien um die hier verwendeten Oligonukleotide für klinische Anwendungen einzusetzen.