Untersuchung der Aggregationseigenschaften und strukturellen Merkmale von amyloidogenen Proteinen in vitro und in der Zellkultur

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Induzierung der Amyloidbildung in der Zellkultur am Beispiel der AA-Amyloidose und der Alzheimer-Erkrankung untersucht. Bei Amyloidosen wie der AA-Amyloidose und der Alzheimer-Erkrankung handelt es sich um Protein-Konformationskrankheiten, die durch die extrazelluläre Ablagerung von Amyloidfibrillen gekennzeichnet sind. Es konnte bereits gezeigt werden, dass diese Amyloidosen durch vorgeformte Fibrillen sowohl in vitro als auch in vivo induziert werden können, allerdings ist der genaue Übertragungsmechanismus sowie der Einfluss der Fibrillenmorphologie auf die Induzierung ungeklärt. Im Laufe dieser Arbeit wurde deshalb die Induzierung der Amyloidbildung im AA-Amyloidose und Alzheimer-Zellkulturmodell durch altes Medium von amyloidbildenden Zellen (konditioniertes Medium) und Fibrillen unterschiedlichen Ursprungs getestet. Dazu wurde das konditionierte Medium bezüglich seiner Bestandteile analysiert und es konnte gezeigt werden, dass die Amyloidbildung hauptsächlich durch die im konditionierten Medium enthaltenen mSAA-abgeleiteten Fibrillen induziert wird. Um den Einfluss der Fibrillenmorphologie und der Sekundärstruktur der Peptide auf die Seeding-Aktivität zu untersuchen, wurden die Fibrillen mit verschiedenen spektroskopischen Methoden und Röntgenbeugung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Sekundärstruktur der Peptide in den Fibrillen deutliche Unterschiede aufweist. Außerdem unterscheiden sich die Fibrillen bezüglich ihrer Persistenzlänge und ihrer Gesamtstruktur. Während die Zellkulturfibrillen an ausgewachsene Fibrillen erinnern, haben die in vitro-Fibrillen eher Ähnlichkeit mit Protofibrillen, was sich auch in den Persistenzlängen widerspiegelt. Mit Massenspektrometrie konnte dann festgestellt werden, dass sich die in den Fibrillen enthaltenen Peptide bezüglich ihres Fragmentierungsmusters deutlich voneinander unterscheiden. Während in den Zellkulturfibrillen hauptsächlich N-Terminale mSAA-Fragmente enthalten sind, konnten in den in vitro-Fibrillen sowohl N- als auch C-terminal verkürzte Peptide detektiert werden. Diese Unterschiede in den Fibrillenmorphologien und in den Strukturen der Peptide spiegelt sich auch in der Seeding-Aktivität der Fibrillen wieder. Hier zeigen die Zellkulturfibrillen eine signifikant höhere Seeding-Aktivität als in vitro-Fibrillen. Parallel dazu wurden auch Fibrillen aus Aβ(1-40) und den N-terminal verkürzten und Pyroglutamatmodifizierten Peptiden Aβ(3-40) und pEAβ(3-40) hinsichtlich ihrer Fibrillenmorphologie und Seeding-Aktivität untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die drei Fibrillen in ihrer Oberflächenstruktur und auch bezüglich der Sekundärstruktur der Peptide in den Fibrillen kaum unterscheiden. Außerdem zeigten alle drei Fibrillen vergleichbare Seeding-Aktivitäten in der Zellkultur. Die Fibrillen der beiden N-terminal verkürzten Aβ Varianten weisen aber deutlich kürzere Fibrillenlängen auf, die allerdings nicht an Tochterfibrillen weitergegeben werden. Insgesamt weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die Oberflächenstruktur von Fibrillen und die Sekundärstruktur der in den Fibrillen enthaltenen Peptide einen starken Einfluss auf die Seeding-Aktivität von Fibrillen haben. Dies Ergebnisse liefern einen Einblick in die Grundlagen des Übertragungsmechanismus von Amyloidosen und weisen auf die Bedeutung der Fibrillenmorphologie für die Seeding-Aktivität hin. Außerdem liefern die Ergebnisse Hinweise darauf, dass die Fibrillenmorphologie und Fibrillenlänge über Peptidmodifikationen beeinflusst und gesteuert werden kann, was für Biotechnologische Anwendungen von großem Interesse ist.