Einfluss der Apoptose auf die Inflammation der Lunge im Rahmen der akuten septischen Lungenschädigung

Abstract

Zunächst wurde eine effektive Methode zur Apoptose-Induktion in Maus-Lungen-Epithelzellen (MLE12-Zellen) etabliert, die im Anschluss daran für die Instillationsversuche verwendet werden konnte. Dabei wurde besonderes Augenmerk darauf gelegt, dass ex vivo eine klare Differenzierung von apoptotischen und nekrotischen Zellen möglich war, was durch verschiedene immunhistochemische Verfahren (AnnexinV/7-Aminoactinomycin, Westernblot und TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)) realisiert wurde. Im zweiten Teil der Arbeit zeigte sich, dass die Instillation von 1x10*4 oder 1x10*7 vitalen oder apoptotischen Zellen in die gesunde Lunge der Versuchstiere geringe immunologisch erfassbare Effekte induzierte. Demgegenüber führte die Instillation von 1x10*7 nekrotischen Zellen zu deutlichen Veränderungen des Zytokinprofils in der bronchoalveolären Lavage (BAL). Während in Lungengewebe oder Plasma, unmittelbar und sechs Stunden nach Instillation, nur geringe Veränderungen beobachtet werden konnten. 24 Stunden nach Instillation zeigten sich die untersuchten Parameter in allen untersuchten Gruppen normalisiert. Somit ließen sich nach Gabe einer hohen Zahl nekrotischer Zellen in die gesunde Mauslunge unmittelbare, (vorwiegend) pro-inflammatorische Effekte nachweisen. Um die maximale Auslastung bzw. Clearance-Kapazität der murinen Lunge zu untersuchen, wurden 1x10*8 nekrotische MLE12-Zellen und Lungenhomogenat in gesunde Tiere appliziert. Die Instillation von 10mg/100µl Lungenhomogenat führte unmittelbar nach Instillation zu einer signifikanten Erhöhung von Interleukin-10 (IL-10) in der BAL, die zwei h nach Instillation nicht mehr nachweisbar war. Sechs Stunden nach Instillation von 1x10*8 nekrotischen Zellen konnte, anders als nach Gabe von Lungenhomogenat, eine deutliche Erhöhung des Proteingehalts in der BAL beobachtet werden. Schließlich erwies sich die Clearance-Kapazität der Versuchstiere, zu den frühen Untersuchungszeitpunkten (0 h, 2 h und 6 h) damit für das Lungenhomogenat als ausgesprochen hoch. Dagegen führte die Instillation nekrotischer Zellen auch sechs Stunden nach Instillation noch zu deutlichen Anzeichen einer Überschreitung der lokalen Clearance-Kapazität. Es bleibt damit vor allem im letztgenannten Fall zu untersuchen, welche Langzeiteffekte in Folge der Verabreichung eines hoch konzentrierten Instillats (≥ 1x10*8 Zellen) zu beobachten sind. Um mögliche additive Effekte in der vorgeschädigten Lunge zu untersuchen, wurde die Instillation des Lungengewebes in dieser Studie im Anschluss an einen thoraxtraumainduzierten septischen Lungenschaden durchgeführt. Dabei wurde insgesamt eine Verstärkung des Lungenschadens, zum hier gewählten Sechs-Stunden-Zeitpunkt, vor allem hinsichtlich der Inflammation, beobachtet. So zeigten sich insbesondere polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN)-attraktive Chemokine, wie macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) und granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) in der Lunge oder keratinocyte-derived chemokine (KC) in der BAL, erhöht. Zur Untersuchung additiver Effekte durch apoptotische/nekrotische Zellen, wurden diese nach Trauma instilliert. Dabei zeigte sich 12 h nach Gabe apoptotischer Zellen insbesondere in der Lunge eine verminderte Konzentration der Chemokine, KC und G-CSF. Zusammen mit milderen aber in der Tendenz vergleichbaren Effekten in BAL und Plasma führte die Gabe apoptotischer Zellen in hoher Zahl, zwölf Stunden nach Trauma, zu einer verminderten systemischen Entzündungsreaktion. Abschließend wurde eine geringe (1x10*4) oder eine hohe (1x10*7) Zellzahl apoptotischer oder nekrotischer MLE12-Zellen, vier Stunden nach Thoraxtrauma und somit 20 Stunden vor zökaler Ligation und Punktion (CLP) instilliert. Die Untersuchung der histologischen und immunologischen Effekte zwölf Stunden nach CLP zeigte insbesondere nach Instillation von 1x10*4 nekrotischen Zellen eine Erhöhung der untersuchten Entzündungsparameter in BAL und Plasma. Dies spricht für eine modulatorische Wirkung einer geringen Konzentration an nekrotischem Zellmaterial. Ein protektiver Effekt in Bezug auf die Schwere des Lungenschadens konnte zum hier gewählten Zeitpunkt weder durch die Instillation apoptotischer, noch nekrotischer Zellen beobachtet werden. Insgesamt konnte die Arbeit zeigen, dass eine therapeutische Intervention durch Verabreichung apoptotischer oder nekrotischer Zellen im Rahmen des Maus-Modells des akuten septischen Lungenschadens möglich erscheint. Jedoch sind die dabei zu berücksichtigenden Parameter, wie der zeitliche Verlauf oder die Stärke des Traumas, sehr komplex und bedürfen daher weiterer Untersuchungen.