Characterization of the role of the CDX2 homeodomain in acute myeloid leukaemia

Abstract

Summary The study demonstrates for the first time that the homeodomain mutant of Cdx2, “Cdx2-HD” provides growth advantage and clonogenic potential in proliferation and CFC assay to haematopoietic progenitors. Additionally, it increased the number of colonies on spleen in CFU-S assay, thus showing the expanded number of short term repopulating progenitors/stem cells. By electrophoretic mobility shift assay (EMSA) we find that Cdx2-HD, because of the N51S mutation, loses its DNA binding potential to Sucrase isomaltase footprint element I (SIFI) and site-D motives of Hoxc-8 enhancer elements. Furthermore, asparagine 51 is dispensable and the newly introduced serine 51 does not interfere with the native subcellular localization of Cdx2: as demonstrated by intracellular immunofluorescence microscopy, Cdx2-HD still translocated into the nucleus of NIH3T3 cells. Interestingly, Cdx2-HD induced acute myeloid leukaemia in the murine bone marrow transplantation model without any change in latency compared to wild type Cdx2. However, in contrast to wild type Cdx2-induced leukaemia, Cdx2-HD generated mixed phenotypes of acute myeloid leukaemia, indicating that the homeodomain of Cdx2 can affect the phenotype of the disease. Thus our model provides for the first time an in vivo functional proof that the direct DNA-binding function of the homeodomain of Cdx2 is dispensable for the leukemogenecity of Cdx2; at the same time our data indicate that the homeodomain is able to modulate the phenotype of acute myeloid leukaemia.Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Expression der Cdx2-Homeodomänen-Mutante “Cdx2-HD” hämatopoietischen Progenitoren eine erhöhte Proliferationsfähigkeit verleiht und das klonogene Potential der Zellen deutlich steigert. Darüber hinaus führte Cdx2-HD zu einer Expansion der Kurzzeit-repopulierenden Stammzellen im CFU-S-Assay. Mittels EMSA konnten wir demonstrieren, dass die N51S-Mutation zu einem Verlust der Bindefähigkeit an SIFI und site-D DNA-Motive von Hoxc-8 Enhancer-Elementen führt. Unter Anwendung von intrazellulärer Immunfluoreszenzmikroskopie konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass das Asparagin 51 nicht essentiell ist und das neu eingeführte Serin 51 die native, subzelluläre Lokalisation von Cdx2-HD nicht verändert: Cdx2-HD transloziert weiterhin in den Zellkern von NIH3T3-Zellen. Im murinen Knochenmark-Transplantationsmodell führte Cdx2-HD mit derselben Latenz zu der Entwicklung akuter myeloischer Leukämie wie Wildtyp-Cdx2. Im Gegensatz zu Wildtyp-Cdx2 resultierte die Expression von Cdx2-HD jedoch in der Ausbildung unterschiedlicher AML-Phänotypen, was darauf hinweist, dass die Homeodomäne den AML-Phänotyp steuern kann.. Unser Modell stellt damit den ersten funktionellen in vivo-Nachweis dafür dar, dass eine direkte DNA-Bindung der Homeodomäne von Cdx2 für die Induktion von AML durch Cdx2 nicht erforderlich ist. Gleichzeitig belegen unsere Daten, dass die Cdx2-Homeodomäne den Phänotyp der AML maßgeblich beeinflusst.