Identifizierung und funktionelle Analyse von am mitochondrialen RNA-Editing beteiligten PPR Proteinen in Arabidopsis thaliana

Abstract

RNA-Editing umschreibt die co- und posttranskriptionalen Modifikation von genomisch kodierten Nukleotiden auf RNA-Ebene. In den Organellen höherer Landpflanzen, so auch denen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, findet dabei überwiegend die Umwandlung von Cytidin zu Uracil statt. Diese Umwandlung wird durch einen flexiblen Proteinkomplex, das Editosom, vermittelt, das sich aus verschiedenen trans-Faktoren zusammensetzt. Neben den PPR-Proteinen, welche die spezifische Erkennung und Bindung der Editingstelle vermitteln, sind weitere trans¬-Faktoren an der Assemblierung sowie Stabilisierung des Editosoms beteiligt. Drei PPR-trans-Faktoren wurden im Zuge dieser Arbeit durch Anwendung eines Vorhersage-Programms identifiziert. Das PPR-Protein MEF35 (mitochondrial RNA editing factor 35) konnte als essentieller Faktor für die Erkennung der mitochondrialen Editingstellen cob-286, nad4-1373, sowie rpl16 209 bestätigt werden. Mit MEF46 konnte ein weiterer mitochondrialer Editingfaktor durch Anwendung des Vorhersage-Programms identifiziert werden. Das PPR-Protein ist essentiell für die Erkennung der Editingstelle nad5-1958. Das PPR-Protein MEF55 wurde als möglicher PPR-trans-Faktor für die Editingstelle atp4 248 prognostiziert und konnte im Zuge der Analyse des Editingphänotyps in den T DNA Insertionslinien mef55-1 und mef55-2 als spezifischer PPR-trans-Faktor für die Editingstellen atp4-248, -250 und 251, sowie nad5-155 identifiziert werden. Darüber hinaus weisen die erfolgreich durchgeführten Komplementationen mit orthologen PPR-Proteinen aus B. oleracea und B. napus auf die konservierte Funktion des MEF55-Proteins als Editingfaktor für diese vier Editingstellen innerhalb der Brassica hin. Durch die Identifizierung der drei PPR-Proteine konnten die Nützlichkeit aber auch die Limitierungen des angewendeten Vorhersage-Programms aufgezeigt werden. Die Expression von artifiziellen PPR-Proteinchimären aus PPR-Motiven mit spezifischer Nukleotidaffinität in planta konnte kein artifizielles Editingereignis in Arabidopsis erzeugen. Auch der Einsatz solcher PPR-Chimären mit nativer mitochondrialer Lokalisierungssequenz sowie C-terminalen Domänen des MEF55-Proteins konnte das Editing an den in mef55-1 betroffenen Editingstellen nicht wiederherstellen. Die Spezifität der PPR-Motive bestimmter PPR-Proteine konnte auch durch die Analyse der Proteinchimäre MEF32-MEF35 bestätigt werden. Gemeinsam mit dieser Analyse deutet dies auf eine Komplexität der PPR-Nukleotid-Bindung hin, die über eine reine Affinität bestimmter Aminosäurekombinationen der einzelnen PPR-Motive zu spezifischen Nukleotiden hinausgeht.