Etablierung und Anwendung eines Zellkulturmodells aus EBV-transformierten B-Lymphozyten zur Untersuchung des Einflusses von zellulärem Stress auf das Protein TDP-43

Abstract

Ziel meiner Arbeit war es, zu überprüfen, ob man die für die TDP-43-Proteinopathien typische, pathologische Anreicherung von TDP-43 (TAR DNA binding Protein 43) im Zytoplasma durch Hitzestress auslösen kann, da Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen vermuten lassen, dass zellulärer Stress eine Rolle in der Entstehung der TDP-43Proteinopathien spielt. Hierfür wurde ein Zellmodell mit Hitzestress etabliert und die Zellen mit Immunfluoreszenz (IF)-Färbungen und Western-Blot weiter untersucht. Als Zelllinien wurden LCLs (Lymphoblastoid cell lines) von drei Patienten verwendet. Hierbei handelte es sich um zwei Patienten mit ALS (ALS/TDP+ #1 und sALS #1), wobei einer eine N352S Mutation im TDP-43 aufweist (ALS/TDP+ #1). Weiterhin wurde eine LCL einer gesunden Kontrollperson (Gesund #1) untersucht, um mögliche Unterschiede zwischen den Zelllinien der Patienten mit und ohne Mutation, sowie der gesunden Kontrolle zu zeigen. Die Zelllinien wurden für 1 h einem Hitzestress von 42 °C ausgesetzt und anschließend zu den Messzeitpunkten direkt nach, 1, 2, 3 und 5 h mittels IF-Färbungen und Western-Blot untersucht. Eine Kontrolle je Zelllinie wurde keinem Hitzestress ausgesetzt. Mittels IF-Färbungen konnte gezeigt werden, dass TDP-43 ohne Hitzestress hauptsächlich im Nukleus lokalisiert ist und sich nur zu einem geringen Teil im Zytoplasma befindet. Direkt nach der Applikation ist bei der Zelllinie ALS/TDP+ #1 eine Verschiebung des TDP-43 in das Zytoplasma zu sehen, diese geht mit der Entstehung von TDP-43-positiven Ablagerungen einher. In den anderen beiden Zelllinien sALS #1 und Gesund #1 kommt es in einem geringeren Maße ebenfalls zur Entstehung der TDP-43positiven Ablagerungen. Diese TDP-43-positiven Ablagerungen lösen sich im weiteren Verlauf wieder auf, was mit einer Rückverteilung des TDP-43 in den Nukleus einhergeht. So sind sie bei der Zelllinie ALS/TDP+ #1 nach 2 h Erholungszeit nicht mehr nachweisbar, während sie bei den Zelllinien sALS #1 und Gesund #1 bereits nach 1 h Erholungszeit nicht mehr nachweisbar sind. Dies passte zu den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, die eine Rekrutierung von TDP-43 in Stressgranula beschreiben, weshalb eine Doppelfärbung mit TIA-1 (T-cell intracellular antigen 1) durchgeführt wurde, einem Stressgranulamarker. Es konnte gezeigt werden, dass TDP-43 und TIA-1 kolokalisiert. Interessanterweise scheint die N352S Mutation im TDP-43 der Zelllinie ALS/TDP+ #1 diesen Effekt zu verstärken. Es könnte sich somit möglicherweise um eine gain of function Mutation in Bezug auf die Stressgranula Entstehung handeln. Um die in der IF-Färbung gezeigte Umverteilung des TDP-43 in das Zytoplasma nach Hitzestress genauer zu analysieren, wurden die Zytoplasma- und Nukleusfraktion der Zellen mittels Western-Blot untersucht werden. Hierfür wurde eine auf Iodixanol basierende Gradientenzentrifugation verwendet. Die Umverteilung des TDP-43 aus dem Nukleus in das Zytoplasma, durch die Applikation von Hitzestress, konnte im Western-Blot allerdings nicht bestätigt werden. So war in allen drei Zelllinien ohne Hitzestress TDP-43 im Zytoplasma nachweisbar ist. Direkt nach der Applikation von Hitzestress konnte jedoch in keiner der drei Zelllinien TDP-43 im Zytoplasma nachgewiesen werden. Das TDP-43 wurde in den Zelllinien nach einer Erholungszeit von 1 h (Gesund #1), 3 h (ALS/TDP+ #1) und 5 h (sALS #1) wieder nachweisbar. Auch zeigten auch die Blots der nukleären Fraktion, das es zu keiner Umverteilung des TDP-43 in den Nukleus kommt, da sich hier nach Applikation von Hitzestress keine Zunahme von TDP-43 zeigte. Im Falle der Zelllinie sALS #1 kommt es sogar zu einer Abnahme des nukleären TDP-43 nach der Applikation von Hitzestress. Diese Ergebnisse lassen, gemeinsam mit den IF-Färbungen, in denen das TDP-43 in zytoplasmatischen Ablagerungen zu sehen ist, am ehesten an eine methodische Problematik denken. So wäre es vorstellbar, dass das in den TDP-43 positiven Ablagerungen gebundene TDP-43, aufgrund seiner erhöhten Dichte, bei der Gradientenzentrifugation abzentrifugiert wird oder sich in der entstehenden unlöslichen Fraktion befindet.